2-1、超薄切片技术原理案例.ppt

透射电镜是利用电子束作为照明源，通过几级电磁透镜放大成像于荧光屏上，因而电子束本身的穿透力弱，在电镜观察之前，必须把样品切成700埃或更薄的切片；或把样品(细菌、病毒、单细胞之类)制成悬液；或把样品（如较硬样品）的表面制成复型等， 我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品制备技术。  用超薄切片法，可得到25埃左右的分辨率；同电镜本身早已达到2-3埃的分辨本领相比，还有相当大的“差距”。 这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发现和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的制样技术。 在电镜技术中，有两种分辨率： 一种是电镜本身的分辨率， 二是样品制备上的分辨率， 同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使细节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。 对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟练地掌握制样技巧是极为重要的一环。 石腊切片机的最高水平可以把片子切到1-2微米。 现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求途径。目前的超薄切片机可以以连续切片的方式把一个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。 目前使用的超薄切片机主要是热膨胀式（瑞典LKB公司制造）和机械推进式（美国的Porter-Blum）两种，的为代表， 与此同时，许多固定、包埋和染色技术的发展和应用，使超薄切片;去成为样品制备中最普遍，而又最基本的方法。 超薄切片制样过程同石腊切片过程大体相似，它分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片等几个环节。 染色 [目的]将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差 固定剂 戊二醛（醛基和氨基反应） 四氧化锇（锇与双键螯合） （两步：戊二醛+锇酸） 前固定：戊二醛固定液（ 2.5%-4% ）中4 ℃冰箱1~2h(中间0.5-1h可取出修块) 后固定：锇酸固定液（1%）中4 ℃冰箱或室温1h 固定液使用磷酸缓冲液配制而成，使用磷酸缓冲液可减少因组织渗透压改变造成的变形。 固定液是样品的40倍 2、 甲醛： 甲醛分子量较小。在组织中渗透快。固定迅速。单独使用时。保存超微结构的效果较差。但能保存某些酶的活性。在电镜细胞化学中常采用。 在一般样品固定时。有时甲醛与戊二醛混合使用效果较好。 一般市售的甲醛中含有抗聚合的甲醇。影响固定效果。因此电镜样品使用的甲醛需用多聚甲醛粉末在使用前自行配制。 配制20%甲醛原液方法： 称30克多聚甲醛粉末（先用乳钵研细再称），放入装有约130毫升去离子水的烧杯中，加热至60-70℃，边搅拌边加入1N NaOH 10-20滴，至溶液透明，以上约需半小时。冷却后过滤，沉淀不到1%。然后加入去离子水至150毫升，放在4℃冰箱内备用。 （2） 梯度脱水 [目的]逐步去除样品中的水，并防止样品收缩，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备。 我们知道，绝大多数生物样品中水分的比例很高，可达70％一80％以上，而水中又有85％一90％为游离态水，再加上包埋剂多为水不溶性物质，因此如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水，将直接影响包埋块的质量，并引起一系列不良后果，如：切片困难和成像模糊等。 为了不破坏其超微空间结构，需进行脱水—— 脱水过程：用系列梯度浓度的有机溶剂逐步替代样品中的游离水，以达到既不破坏超微结构，又能彻底除去样品中的游离态水的目的过程。 *可停在70%过夜，不能在其它浓度过夜 *100%加干燥剂（如无水硫酸铜）保存在干燥器中 以上为常规制样，脱水过程可根据样品不同进行调整，如植物样品可适当延长脱水时间。 脱水剂：既能与水相溶又能和包埋剂相溶。常用乙醇和丙酮。 如果迅速脱水(如直接用100%)，会使样品水分抽取，造成萎缩等变形。 脱水顺序： （3） 浸透与包埋 [目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 超薄切片机 目前有许多种型号的超薄切片机，但主要包括两类： 1、热胀式切片机 如瑞典LKB公司产品 2、机械式切片机 如德国leica公司， 美国RMC公司 切片机的工作基本原理： 1、热胀式切片机 利用金属杆热胀或冷缩时产 生的微小长度变化来提供推进 2、机械式切片机 用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进 我国使用较多的是瑞典LKB公司产品 随着机械加工水平提高，目前市场上新产品都是机械式超薄切片机 我校为LKB公司的LKB-V型热胀式切片机 热胀式切片机的工作原理： 打开开关—金属膨胀杆内线圈通电—膨胀杆加热—膨胀杆带动样品向前膨胀—马达带动样品上下运动—样品经过刀口—切割 20分钟左右的时间里，金属膨胀杆可保持均匀而准确地线性膨胀。 为