第五章固相析出分离法概论.ppt

第五章 固相析出分离法 目标 掌握：盐析的原理及影响因素；有机沉淀的原 理、常用有机溶剂，等电点沉淀的机制 饱和溶液和过饱和溶液的概念 熟悉：盐析的操作过程和注意事项；有机沉淀 操作条件的控制，操作过程中应注意事项 结晶的一般步骤 了解：其他沉淀法 一、概述 1.定义——改变溶液条件使目标产物或杂质的溶解度降低而形成固体沉淀从溶液中分出的操作技术 析出物为晶体时称为结晶，析出物为无定形固体时称沉淀法 2.特点——浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化倍数低 3.缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 4、类型 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 高分子聚合物沉淀法 金属离子沉淀法 6) 结晶法 一般沉析操作的过程 Step 1 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； Step 2 沉淀物的纯化，促进晶体生长； Step 3 离心或过滤，收集沉淀物； 二、盐析沉淀法 1.定义——是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 ★盐析法应用最广的是在蛋白质领域，已有八十多年的历史,除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： 无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁 盐析剂的选择 盐析剂的条件 盐析作用强： 盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子 较大溶解度 生物学上是惰性的 来源丰富、经济 常用盐析剂—(NH4)2SO4 、Na 2SO4、磷酸盐等 影响盐析的因素 无机盐的种类 溶质种类的影响：不同蛋白质所需无机盐不同 溶质浓度的影响： 蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值，使其在pI附近； 盐析温度： 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降 盐析用盐的用量选择 饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例： 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度 盐析操作方式及方法 操作方式 固体盐加入 饱和盐溶液加入 饱和度 方法 分步盐析 重复盐析 反抽提法 盐析沉淀法的特点 沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活； 非蛋白的杂质夹带沉淀很少； 适用范围广； 盐份含量高。 突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 有机溶剂沉淀 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 有机溶剂的选择 介电常数要小 对生物分子的变性作用小 与水互溶 安全、无毒、价廉、易回收等 常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 有机溶剂沉淀的特点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，固液分相容易，有机溶剂易祛除 易使蛋白质变性失活 安全性差 成本较高 影响有机溶剂沉析的主要因素 温度：大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变