二倍体细胞株的培养.doc

二倍体细胞株的培养 二倍体细胞是指来自动物组织的细胞群体，在体外能进行有限连续传代培养的细胞。人二倍体细胞株的传代寿命通常为40~60代，达到一定传代水平时，细胞必然发生衰老、退化以及死亡。在进入衰老死亡之前，任一传代水平细胞的染色体组型保持正常二倍体染色体数目，具二倍体的细胞数，应占所检查分裂中期细胞总数的75%以上，而且染色体的结构异常也必须在正常范围内活动。二倍体细胞可来自动物和人的多种组织，用胚胎组织或成龄组织均可建株，但应用最多的是用人胚肺所建的二倍体细胞株，如WI-38，MRC-5，MRC-9，IMR-90，WI-26，RPL-1等株。二倍体细胞株虽具有一定生命期限，但其细胞株在衰老前任一传代水平都可将多余的细胞冻存起来，而在需要时复苏重新培养使用，因此一个细胞株所能供应的使用量也是非常巨大的。由于二倍体细胞是有限传代培养，或者它与个体的寿命相关，与其来自肿瘤的无限传代细胞系相对照，所以是肿瘤研究与老龄化研究的重要研究对象之一。又因它无致癌性，所以在病毒学、细胞学、生物遗传学等研究方面有着广阔的使用前景，尤其在生产病毒等疫苗方面，提供了安全，适用的良好细胞。 二倍体细胞的寿命以细胞群体倍增（population doubing,PD）作为计算单位。如传代接种的细胞数，经分裂增殖使其细胞数增长一倍，即称为一个PD。换言之，一瓶长满单层的细胞以1：2分种传代（接种相同培养面积的2瓶），待细胞长满2瓶时，约等于1PD；如按1：4分种（接相同大小4瓶）待长满时为2PD。但二倍体细胞一般只用1：2分种，人胚肺来源的二倍体成纤维细胞，可培养50~70PD，即50~70代。二倍体细胞传至一定PD水平，逐渐退化、衰老而死亡。为使用活力旺盛的细胞，一般应用到寿命的2/3PD水平为宜。 空斑法测定单传疱疹病毒（HSV） Dulbecco等以噬菌体的溶菌斑为启示，研制出动物病毒形成空斑法（plaque）,用细胞培养法来进行病毒的定量检测，本试验用Vero细胞的单层培养进行HSV的空斑定量。 [材料] 细胞：Vero细胞单层培养60mm平皿或培养瓶18只。 培养液：10×MEM培养基（不含NaHCO3和酚红），1%中性红（NR）液，7.5% NaHCO3，小牛血清（CS），琼脂、无菌蒸馏水。 病毒液：HSV-I型（约106TCID50/ml） 其他：各种吸管（1ml刻度吸管15支），灭菌小试管9支，试管架、冰浴槽，50℃水浴箱。 [方法] 病毒的稀释与接种：继续用实验中冻存病毒液，用9支试管将HSV作10倍稀释，从10-5之后加半log稀释到10-7。 试 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 稀释倍数 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5.5 10-6 10-6。5 10-7 HSV 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.63 0.63 0.63 0.63 PBS 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.37 1.37 1.37 1.37 于18只平皿或培养瓶的细胞上接种病毒液，分PBS及病毒稀释液10-7、10-6。5、10-6、10-5.5、10-5等6组接种，每组设3只平皿或培养瓶，每皿（瓶）接种0.2mL，充分铺满并吸附1.5h。 2.琼脂培养基的调制及琼脂培养基的重层：分别配制培基A与B，将两者混合并迅速吸出4mL加入平皿铺盖于单层细胞表面，放室温固化。 培养基A 培养基B 10×MEM（不含酚红） 9.5ml 琼脂 1.5g CS 5.0ml 蒸馏水 50.0ml 7.5%NaHCO3 2.9ml 121℃高压灭菌15min后降至50℃左右无菌蒸馏水 32.6ml 置50℃温浴中。 37℃恒温槽温浴 50.0ml 培养基A与B迅速混合，铺盖于活细胞上固化后，置37℃培养4天。 3.染色及空斑计数：4天后加培养基C2ml，等琼脂固定，避光3