普通生物学实验 实验二动物可溶性蛋白含量测定.pptVIP

指导老师：辛德东 一、实验原理 考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，最大光吸收595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，而与分子量无关。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。 吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。 二、实验材料、仪器及试剂 1．材料：鸡血清2．仪器：分光光度计、移液管、试管、试管架 等 3．试剂：（1）标准蛋白（100 ug /ml） （2）考马斯亮蓝：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏 水定容至1000ml。 三、实验方法 标准曲线制备：按下表数据配制一系列不同浓度溶液的标准蛋白溶液（0-5号管）和样品溶液（6-7号管） 0 1 2 3 4 5 6 7 Pr (100 ug/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — — 待测液 — — — — — — 1.0 1.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.0 1.0 考马斯亮蓝 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，静置5 min 595 nm测光吸光值（A），以吸光值为纵坐标，标准蛋白的浓度为横坐标，制作标准曲线。 根据标准曲线求血清蛋白含量