一种新型均相荧光共振免疫检测法的建立.pdfVIP

疆建In。 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 一种新型均相荧光共振免疫检测法的建立于 管宝全罗文新王明桥程通顾颖张军‘夏宁邵 (361005厦门，厦门大学福建省医学分子病毒学研究中心) 摘要：目的建立一种用于检测抗原的新型均相荧光共振免疫检测法(hFRIA)。方法利用 大肠杆菌表达系统，在HBV 绿色荧光蛋白(GFP)进行融合表达，得到融合蛋白Gall；原核表达MAl8／7的轻链可变区， 纯化后与荧光淬灭剂QSY35偶联，得到标记抗体QL。分别以GaH和QL作为均相荧光共振 免疫检测体系的能量供体和能量受体建立hFRIA，并对preSl抗原进行检测。结果融合蛋 白GaH能够较好的保持GFP的荧光性质和亲本抗体的抗原结合活性，标记抗体QL能够较 好的保持抗原结合活性，由二者构成的检测体系可以快速便捷的检测HBV pre—SI抗原。结 论这种基于绿色荧光蛋白和小分子抗体的均相荧光共振免疫检测法可以实现对目的抗原 的快速检测。 关键词：均相荧光免疫共振检测法，绿色荧光蛋白，小分子抗体 免疫检测的自动化和简便化是免疫检测发展的最主要方向之一。均相免疫测定因其不需 要分离结合与未结合分子即可直接测定以及均相反应较固相、半固相反应更为迅速的特点而 倍受关注。在光谱重叠的两个荧光分子之间存在着荧光共振能量转移(FRET)过程，即一个 受激发的荧光基团(供体)将其激发态能量转移给一个光吸收分子(受体)的过程，如果受 体的激发波长与供体的发射波长重叠，则供体的发射光会被受体吸收耳百减弱。利用此原理建 立的均相荧光共振免疫测定(hFRIA)可以实现抗原一抗体反应的均相测定【I’2】。目前能量供 体和受体一般采用化学合成荧光素[31或镧系元素【4】，需要相对较为繁琐的标记过程。绿色荧 光蛋白(GFP)是具有荧光特性的蛋白质分子，作为标记分子在生物学研究中秋得了广泛的 应用。GFP与抗体的融合表达可以避免小分子荧光素抗体的标记过程【5】。本研究利用该特性 以及抗体活性部位由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)共同形成的特剧61，分别表达 VH与GFP的融合蛋白以及用淬灭剂标记vL，组成FRET蛋白对，利用抗原与抗体结合后 对FRET强度的影响，以乙型肝炎病毒(HBV)preSl抗原的检测为模式，建立了一种新型 hFRIA方法。 1材料和方法 1．1细胞、菌株和质粒 可分泌抗HBV 1的鼠杂交瘤细胞系和可分泌抗戊型肝炎病毒 pre—S1单克隆抗体4D1 (HEV)单克隆抗体8C11的鼠杂交瘤细胞系由本实验室制备：大肠杆菌DH5ct株和ER2566 +“863”计划海洋生物技术主题资助(2001AA628120，2004AA628070) +通讯作者。Email：zhangj@xmu．edu．cn 739 福毽|n 第三届海洋生物肓技术论坛 2005．08．19-23 株由本室保存；质粒pTO—T7由本室构建保存‘71，载体pMDl8-T购自大连宝生物工程有限公 8／7一VL【8J由 司，质粒pEGFP购自Clontech公司，质粒pTO—T7．MAl8／7一VH和pTO—T7一MAl 本室构建保存。 1．2酶及其他生化试剂 限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司，T4DNA连接酶购自华美生物工程有限公 司，DNA柱式胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司，PCR用Taq酶、dNTP购自上海生 工生物工程公司。基因合成、引物合成以及测序均由上海博亚生物技术有限公司完成。荧光 Probes公司。 淬灭剂QSY一35购自Molecular 1．3抗HBV preSl单克隆抗体 抗HBV 与轻链可变区VL片段本身均不能直接结合HBV