临床生物化学相关研究——分子生物学技术在临床微生物检测和研究中的若干问题.pdf

临床生物化学相关研究 分子生物学技术在临床微生物检测和研究中的若干问题 鲁辛辛 当人类受到病原微生物侵袭时，医学界始终致力于在第一时间内采取最有效措施控制疾 病蔓延，希望能以最快的速度掌握病原菌的生物学特征。但是近30年全球流行病趋势表明： 致病微生物越来越以微小多变甚至以分子的形式穿越人类世界，难培养和不能培养病原菌成 为传染性和感染性疾病的首要宿敌。目前国内较好的临床微生物实验室多局限在可培养需氧 细菌、兼性厌氧菌、真菌和少部分厌氧菌的分离鉴定上。距离难培养和不能培养微生物信息 获取相却甚远，其中的原因不乏微生物检验理念落后和对先进技术感知迟缓。对病原菌的识 别靠传统方法或简单的技术难以奏效，因此，在体外培养和免疫学技术的基础上，辅助分子 生物学的鉴定技巧，将使微生物检验和研究能力有所提高。当然实践分子生物学技术并不轻 松，在应用中会有障碍，下面就临床常遇到的问题展开讨论： 一．病原微生物鉴定方法多元化 在发现传染病的诸多途径和方法中，最重要和有效的途径是通过临床医生和实验室技术 人员对疾病和病原菌的描述。对熟悉的传染病已有固定的检查方法和流行病学追踪手段。当 发现不能确诊的疾病现象时，首先应该有怀疑新发传染病的意识，立即借助微生物学、免疫 学技术和分子生物学等方法寻找致病菌。在推断感染病原体的基本原则中有一条是关键的， 即在患者体内分离出致病菌或查到致病菌基因序列，这是传统培养方法与分子生物学鉴定技 术相互融和的结果【l-2】。感染性疾病至少可从以下5种方法和技术中寻找答案。 (一)形态学检查及体外培养技术——革兰染色、特殊染色、抗酸染色、直接荧光染色、 细胞内病原体颗粒的细胞学检查(组化染色和单克隆抗体染色)以及电镜技术。细菌培养(根 据不同部位可能出现的细菌选择培养基)、真菌培养、厌氧菌培养、细胞培养及动物培养等。 (二)基因识别与基因指纹技术——直接从感染标本中扩增分析致病菌或致病基因，如： rRNA、16-23SrRNA rRNAITS 细菌16S ISR(核糖体RNA基因间隔区)：真菌18SrRNA、18S一23S 和GTS(核糖体RNA基因间隔区)；致病菌sodA(超氧化物歧化酶基因)和hsp60(热休 克蛋白基因)、耐药基因和编码毒素的基因。基因指纹对可培养微生物的种群分类、基因结 构分析和病原菌的流行病学研究有较高的学术价值。如：RLFP(限制性内切酶片段长度多态 ．551． 列PCR)。 (三)杂交与探针技术——用于已知微生物的检测与验证。直观、特异性强、可直接从 标本中实现。如：核酸杂交、原位荧光杂交、基因探针等。 (四)免疫学试验——即针对微生物本身也可检测血清中抗体，适合已知病 毒、衣原体、支原体等难培养微生物，具有较高的诊断价值。 临床检验中心通讯作者：鲁辛辛， 电子信箱：luxinxin@trhos．com (五)DNA微点阵技术和PyrosequencingDNA分析技术——可以快速、高效、大规模地 获取微生物信息。PyrosequencingDNA以微生物特异短片断SNP(单核苷酸多态性)为基础， 同时可进行上百种DNA模板的检测【31。 第一项是最重要的也是必不可少的，无论采用怎样的分子生物学技术，我们都希望能看 到病原微生物个体或培养物，但是这其中电镜技术、厌氧培养技术、细胞培养技术对于临床 实验室仍有相当难度，在突破基因诊断技术难关的同时，应加强微生物体外培养技术的研发。 二．结合自身优势建立分子生物学技术平台 对传染性和感染性疾病的了解总是从医院开始的，但是至今我们对致病微生物的认识仍 有很多盲区。分子生物学实验室完成的是一个由简单到复杂的技术过程，而技术的建立往往 根据学科特点逐渐发展起来，如从简单的质粒图谱到基因序列分析，从单一方法到多元技术。 但是无论哪一种方法，首先核酸提取技术必须过关。虽然商品化试剂方便了分子生物学技术， 但并不是所有微生物或所有标本都适用。几乎每个实验室都有自己分离分析核酸的独到之 处，以下介绍几种适合临床开展的分子微生物学检验与研究技术： (一)以序列分析为基础的分类鉴定技术：适合微生物的准确分类鉴定和进化关系研究。