乳糖对甲基对硫磷水解酶的诱导作用及培养条件的优化.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四班奎圆发酵工程学术讨论套论文栗 乳糖对甲基对硫磷水解酶的诱导作用 及培养条件的优化 林恒1，赵晓丽，刘卫东， 曹 慧，李顺鹏，崔中利2 (南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京21095) coli 摘要：基因工程苗E BL21／pET32a-mpd可J；【诱导表迭重组的甲基对砘磷水解酶 (MPH)，为了实现工韭化大量生产MPH，使用乳糖为蒋导剂，首先考察了碳豫、氪源、盎属 高子、培养温度、乳耱浓度及诱导时问莘对产辟的影响，得到了优化的发酵来件，k(3‘)正麦 实验进一步确定了最佳的碳源、氟源及乳糖浓度。在此基础上利用7L自控发酵罐进行了商 45 ml，经过盒属亲和蟹舍层析桂纯化，得到有活性的MPHmg／L． 关键伺：甲基对砘磷水解酶；乳耱I正交实验；条件优化；高密度发酵 随着农药的过量和不恰当使用。土壤和农作物中农药残留问题日趋严峻，危及到了 人民生活以及国名经济的可持续发展。根据近几年来对我国各省的蔬菜调查表明，有机 磷农药残留问题非常突出，甲基对硫磷为主要的有机磷农药超标品种之一[1”。因此．去 除土壤及农作物中有机磷农药残留是一个迫切需要解决的问题。本实验室从甲基对硫 磷降解菌(Plesiomonassp．M6)中克隆到了甲基对硫磷水解酶基因mpdr“。该基因不同 与对硫磷水解酶基因opd，它能够水解甲基对硫磷，并且对于辛硫磷、对硫磷、毒死蜱、敌 百虫、敌敌畏等农药也有降解效果。但是MPH在M6中表达很低，分离纯化比较困难， 我们已经成功地构建了MPH重组表达菌株E．coli IPTG是实验室中应用最广的表达载体T71ac启动子高效诱导剂，但对人体具有潜 在的毒性且价格昂贵””。为了大量制备MPH来生产酶制荆等产品来解决蔬菜的农药 残留问题，我们使用乳糖替代IPTG诱导工程菌株表达重组蛋白．很多文献表明，乳糖除 了可以诱导重组蛋白的表达，还可以作为菌体生长所需的碳源，增加菌体产量和外源蛋 白的表达量，并且可以降低生产成本，保证产品的安全性，在基因工程产品产业化中有实 际意义。由于乳糖诱导较之IPTG诱导的条件变化较大，需要大量实验来确定最佳的生 产条件，我们在乳糖诱导条件下，在摇瓶条件下优化了培养基成分，研究了不同的乳糖浓 度和诱导时间、温度对工程菌重组蛋白表达量的影响，并进行了7L发酵罐的高密度发 酵，为重组甲基对硫磷水解酶的工业化生产奠定了基础。 基金项目：363计划(2004AA246070)和国家自然科学基金资助项目． 作者简介：林恒，女，1982年生，硕士．研究方向t环境微生物学与工程． E-maihlinherI90211@126．COm 林恒等：乳糖对甲基对硫磷水解酶的诱导作用及培养条件的优化 1材料与方法 1．1主要试剂 甲基对硫磷购自上海农药研究所；Ni—NTA 国产分析纯；发酵罐为镇江东方生物公司GUJS-70型发酵罐。 1．2菌种 达载体为pET29a(+)，目的基因为mpd，来自Plesiomonassp．M6，载体带卡那霉素扰 性。 1．3培养基殛培养条件 保藏及种子培养基皆为含50mg／L卡那霉素的LB培养基。摇瓶培养基础培养基 14．6；KH2PO,3．0；NaCl0．5；NH4CI (g／L)INazPHq．12H=O 1．0；MgSq．7H20． 0．25。发酵条件的优化在三角瓶中利用单因子法顺序进行，每项优化的结果都用于以后 的实验，以茵体浓度和MPH的表达量为指标；发酵罐发酵按优化的结果进行。 发酵罐工作体积5L，接种量10％，种子液为培养12h的摇瓶培养液，pH通过添加 速率控制在30％左右，诱导前温度37℃，诱导温度30(2，发酵过程中3～5h期间恒速流 加1009甘油的补料，5～10h期间间歇补加509乳糖的补料，各数据由微机自动收集和记 录． 1．4测定方法 1．4．1菌体粗酶液制备及酶活的测定方法同参考文献嗍’ 1．4．2蛋白质含量的测定方法根据考马斯亮蓝G一