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低丰度表达蛋白免疫金标记技术的研究 李凡 胡东维 陈锋 (浙江大学生物技术研究所，杭州310029) 随着分子生物学技术的不断发展和完善，以胶体金标记技术为主的新的分子细胞学技术越来 越受到人们的重视，被，1‘泛应用于特异性蛋白、特异性糖基、细胞识别受体以及核酸表达等研究 中。在免瘦金标记中，抗血清与非抗原之f曰往往会发生交叉反席，其产生的原因是不同蛋白之间 某些抗原决定簇可能是类似的或者是抗原蛋白不纯。由于一般的免疫金标记实验中，目的部位的 标记密度很高，而交叉反应的密度相对很低，因此很容易判断出特异性的标记位点。而对低丰度 表达的蛋白进行免疫定位时。其本身袭达量非常的低导致很难将其特异性的标记位点与交叉反应 区分开来。因此，对低丰度表达的蛋白进行免疫金标记就显得相对比较困难，很有必要对其标记 技术进行系统的研究。 野生的M／o基因部分缺失或移码突变后就演变为了mlo基因…。具有mlo基因的大麦不但能 够抵抗己知的所有30多个大麦白粉病菌生理小种，而且抗性水平极高1。”。进一步的研究表明 Mlo是一种低丰度表达的蛋白【1】。而且目前对M／o基因的表达和积累过程还不清楚，也没有从超 微结构水平上对其进行免疫定位的研究。因此，本研究选取在植物中低丰度表达的Mlo蛋白为 研究对象，对不同标记条件对标记结果可能产生的影响进行了系统的分析，为Mlo蚩白的免疫 定位研究奠定了基础，同时也为低丰度表达蛋白免疫金标记技术的改进提供了条件。 1材料与方法 1．1供试材料与接种处理 1．1．1供试植物与病原菌 本研究采用的小麦品种为济南17(感白粉病菌)；小麦白粉病菌为禾白粉病菌小麦专化型 (Blumeriagraminis￡sp．tritici)015号小种，由本实验室保存。 1．1．2培养方法 crll，然后盆栽，在温度为19(2， 小麦种子先在28C的培养箱中催芽}3天，使其根长到大约l 光照为12h,照明／12h黑暗，湿度为70％-90％的光照培养箱中进行培养。白粉病菌也是在同样的 条件下在小麦上进行转接繁殖的。 1．1．3接种方法 在播种后第10天，在第～片充分展平的叶子上用滚动法进行接种。接种后放在湿度为100％ h照明／12h黑暗，湿度为70％-90％ 的黑暗条件F保湿12h。然后再在温度为19。C，光照为12 的光照培养箱中进行培养。 1．2一抗抗血清 血清以及绿色木霉纤维索酶的抗血清均由本实验室制各。Rubisco抗血清由浙江大学蒋德安教授 惠赠。 1．3免疫细胞化学分析 对感染自粉病菌的小麦叶片进行低温包埋，低温包埋样品的制备参照赵淑芳等的方法进行 【6]。聚合好的样品用钻石刀进行超薄切片后收集到镍网上。 65 按Slot和Geuze的方法制备商径为10 m的胶体会‘”。在pH6．0的条件F，将蚩白A’j直 径为10 nlTl Iln2的胶体金结合制各间接标jl探针；在prt9．0的条件F，将羊抗兔lgG与直径为10 的胶体金结合制备间接标记探针。标记反应在28℃的条件下采用液滴悬浮的方法进行。具体步 骤为：水滴悬浮5 1％NaNl)封闭1h； 抗(抗血清稀释100倍)处理1 h；水滴悬浮2次，每次5枷n；BI。再封闭1h；二：抗胶体金 探针标记1h；水滴悬浮3次，每次5mm。标记后的超薄切片经醋酸取氧铀和柠檬酸铅双染色后， JEM．1230透射电镜下进行观察。 1．4统计方法 每一个样品共随机选取20个视野，每个视野大小为2×1u矗，然后进行统计分折，以每平 方微米的胶体金颗粒数目表示标记密度。 2结果与分析 2．1一抗缺失法和一抗替换法的对照实验 利用蛋白A和羊抗兔IgG两种胶体金探针分别对感染白粉病菌的小麦