实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.doc

实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 二、原理 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳：采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维薄膜电泳法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅12μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。 三、器材 1．醋酸纤维薄膜（2×8cm） 2．常压电泳仪 3．点样器 4．培养皿 5．粗滤纸 6．玻璃板 7．竹镊 8．白磁反应板 9．新鲜血清 四、试剂 1．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07） 巴比妥2.67g，巴比妥钠15.45g，加水至1000m1。 2．染色液 含氨基黑10B 0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，水40m1。 可反复使用。 3．漂洗液 含甲醇或乙醇45 m1，冰醋酸5ml，水50m1。 4．透明液 含无水乙醇7份，冰醋酸3份。 五、操作 1．浸泡： 用镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别光泽面与元光溶面，并在一角做上记号），放在缓冲液中浸泡20min。 2．点样： 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后将无光泽重面朝上平铺在玻璃扳上。将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下，再在膜一端1.5cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上细条状的血清样品。掌握点样技术，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 3．电泳： 如图1.在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽的液面等高，将膜条无光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁）。膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压90～100V，电流强度0.4～0.7mA/cm2，通电45～60min，待电泳区带展开2.5～3cm时，关闭电源。 ４．染色： 电泳完毕后，将膜条取下放在染色液中浸泡10min。 5．漂洗： 将膜条从染色液中取出后，在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。从正极端起，依次为：清蛋白、α1蛋白、α2球蛋白。β蛋白、γ球蛋白。如图2所示： 定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪下，分别浸在0.4N NaOH溶液中，并剪下相同大小的无色区带，膜条作空白对照，迸行比色；或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3min后贴于洁净玻璃板上，干后，即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。 实验二 酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酶蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1．牛奶 2．离心机 3．抽滤装置 4．精密pH试纸或酸度计 5．电炉 6．烧杯 7．温度计 四、试剂 1．95%乙醇 2．无水乙醚 3. 0.2MpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 A液：0.2M醋酸钠溶液 B液：0.2M醋酸溶液 称有机纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g,定容至1000ml 4.去A液1770ml,B液1230ml混匀，即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。 5.乙醇乙醚混合溶液：乙醇:乙醚=1:1（V/V） 五、操作 1.将100牛奶加热到4℃。边搅拌边缓缓加入预热至40℃的缓冲液，并调节pH之后，冷却至室温。以3000r/min离心10min。弃去上清液，得酪蛋白粗制品。 2.用水洗涤三次，3000r/min离心，弃去上清液。 3.在沉淀中加入乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液沉淀两次，最后再用乙醚沉淀两次，抽干。 4.将沉淀摊开在表面皿上，干燥后得酪蛋白纯品。 5.准确称量后，计算含量，并与理论含量（3.5g/100ml）相比求出实际得率。酪蛋白含量g/100ml：牛乳(g%) 得率=100% 实验三 甲醛滴定法测氨基氮 一、目的 初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。 二、原理 水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，可形成—NH—CH20H，—N(CH2－0H)2等羟甲基衍生物，使NH3+放出的H＋游离出来，这样就可用碱滴定放出的H＋，测定氨基氮，从而计算出氨基酸的含量。 若样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量