分子生物学实验指导终稿.docxVIP

分子生物学实验B 实验指导 ? 实验一?植物总DNA和RNA的提取与鉴定 （一）?植物总DNA的提取 一、目的与要求 1、学习和掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。 2、掌握紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度的方法。 二、实验原理 CTAB法是一种提取植物总DNA的常用技术。CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的缩写，是一种非离子型去污剂。植物叶片经液氮研磨导致细胞壁破裂后，加入去污剂CTAB，可使核糖核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化DNA。CTAB与核酸形成的复合物在高盐（0.7mmol/l NaCl）浓度下可溶；但在低盐浓度（0.1～0.5 mmol/l NaCl）下沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。 核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280约1.8，且1μg/ml的DNA溶液A260约0.020。 三、基本步骤 ?1.称取0.2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，吸水纸轻轻吸干水分； 2.将叶片剪成1cm长，置研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末； 3.在液氮完成挥发之前，将粉末转入加有750μL预热（65℃）的CTAB提取缓冲液的2mL离心管中，65℃水浴保温30-60 min，不时地轻轻摇动混匀，使其充分裂解； 4.取出，冷却到室温，加入等体积（750μL）的24：1的氯仿/异戊醇，盖上盖子，温和摇动，使成乳状液，静置10min； 5. 10000rpm离心10min； 6.取出离心管（出现3层），小心地吸取上层清液转移到干净的2mL离心管中（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次，去除杂质）； 7.沿离心管壁慢慢加入2倍体积预冷的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇），（注：为使DNA沉淀完全，可将离心管放于－20℃冰箱中，静置30min以上）。 8.10000rpm离心10min，并室温干燥（或真空干燥）。 9.?用0.2ml 70％乙醇洗涤沉淀?1次，室温下微干，加入70μl?高盐TE缓冲液和1 μl的RNaseA，颠倒混匀，37℃保温0.5h。 10.将沉淀用70%乙醇清洗两次后，晾干，加入50μl TE或无菌水溶解沉淀。 11.加入2倍体积预冷的无水乙?醇，充分混匀，于4℃,7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min。 12.测定该溶液在紫外光波260nm和280nm的吸光值计算提取DNA的浓度(也可同时进行琼脂糖电泳)。 五、实验材料与耗材 1、实验材料：植物叶片（幼嫩叶片为佳）。 2、耗材：2ml离心管×1，玻璃棒×1，陶瓷研钵和杵子×1，50ml烧杯×1，剪刀×1，滴管×1。 3、试剂：液氮，CTAB，Tris碱，Na2EDTA，NaCl，β-巯基乙醇，盐酸，氯仿，异戊醇，乙醇 六、仪器与设备 冰箱，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计 七、注意事项 1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。 2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。 （二）植物总RNA的提取和含量测定 一、目的与要求 1、了解RNA的特性。 2、掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。 二、实验原理 RNA分子是化学性质非常活跃的分子。在提取细胞内RNA的过程中，RNA分子容易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而破坏分子结构，导致提取失败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放的核酸酶活性。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总的RNA。 三、基本步骤 1、称取1g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，吸水纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的陶瓷研钵中，倒入液氮，快速研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，快速称取0.1g粉末移到1.5ml离心管中，加入1ml? Trizol.试剂,充分振荡,冰上静置3～5min。 4、加入200μl氯仿/异戊醇(24:1)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。 5、离心12000rpm，4℃，10min。 6、将上清液小心转移到新1.5ml离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，-20℃，30分钟。 ???注：不要吸取任何中间层物质，否则会出现DNA?污染。 7、离心12000rpm，4℃，5分钟。 8、小心移去上清液，防止沉淀丢失。 9、加入700μl 70%酒精洗涤，离心12000rpm，4℃，5分钟。 10、重复步骤‘9’。 11、离心结束后，弃去上清，防止丢失RNA沉淀。 12、室温干燥，让乙醇挥发完全。 13、加入30～50μl的DEPC水溶解，可以-70℃保存。 注：可以采用电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度情况。 四、溶液配制 1、Trizol试