实验1细胞培养概述-精品学习网.doc

实验1 细胞培养概述 （一）细胞培养室的设置和无菌操作 【】【】①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【】①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 ②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 ③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。 ④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1：放置未消毒物品。 ⑥储品柜2：放置已消毒物品。 准备室注意事项： ①预防蒸馏器被烤干。 ②勿将酸液溅到衣物或地面。 ③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 （2）配液室的设备 ①天平（扭力天平和电子天平）：称量用 ②pH计。 ③磁力搅拌器。 （3）细胞培养室的设备 ①超净工作台： 超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。 使用超净工作台应注意的几点问题： A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。 B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 D．净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。 E．一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。 F．每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。 ②4℃冰箱和低温冰箱： ③CO2培养箱： A．一定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。 B．一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。 C．它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。 D．培养箱内装有紫外灯。 E．通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。 F．在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。 ④离心机： ⑤CO2钢瓶： ⑥液氮罐： ⑦储品柜：用来存放杂物 ⑧紫外灯： ⑨空气净化系统 ⑩倒置显微镜 3．无菌操作 （1）无菌室的灭菌： ①紫外灯无人时就要打开； ②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩； ③每周清洗消毒一次； ④所用物品要以外科手术方式严格消毒； ⑤室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等； ⑥所用物品要一次性准备好； ⑦瓶口要用酒精火焰消毒； ⑧尽量减少出入。 （2）实验人员的无菌准备： ①肥皂洗手 ②穿好隔离衣 ③酒精棉球擦手 【】【】【原理】【】【仪器、材料及试剂】μm微孔滤膜。 3．试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。 【】①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。 ②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。 ③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。 ④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿