叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法.doc

叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法 1 叶绿素含量测定： 80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。 称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36） 也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰 Ca=13.95D665-6.88D649 Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245 ? 2 抗氧化酶活性的定：（2.5g样） 0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。 取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。 ? 2.1丙二醛（MDA）的测定： 20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）； 0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）； 0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124） 2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定： NBT(400ml)混合反应液: 392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液 （100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。 （另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na 测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。 ? ? 2.3过氧化物酶（POD）的测定： 0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。 0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。 0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。 2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。 2.4 脯氨酸的测定 标准曲线的制作： 编号 1 2 3 4 5 6 7 标准脯氨酸的量（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 H2O（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 冰乙酸（ml） 2 2 2 2 2 2 2 显色液（ml） 3 3 3 3 3 3 3 脯氨酸含量（μl） 0 1 2 4 6 8 10 ??? 0.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。 2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》） 牛血清白蛋白：配成100μg/ml和1000μg/ml。 90％乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。？？？