微生物脂肪酶的纯化方法.pdfVIP

第21分会场 生物技术产业化485 ==— 微生物脂肪酶的纯化方法 张艳红 王小芬 王俊华 杨 洁 新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐，830046 摘要脂肪酶普遍存在于多种微生物中，如细菌、酵母和真菌。微生物脂肪酶在有水或 无水条件下能催化大量的反应，所以在生物催化方面占据重要地位。从微生物中得到的脂肪 酶大多已得到了纯化。纯化后的脂肪酶可用于测定序列和研究其立体结构，从而更好地理解各 种不同的水解反应和合成反应中它们独有的结构功能关系。本文主要对应用在微生物脂肪酶 的各种纯化方法及脂肪酶的应用方面进行了阐述。 关键词 酶学 微生物脂肪酶纯化 一、前言 物组织、植物种子和微生物体中。脂肪酶能催化天然底物油脂(甘油三酯)水解，产生脂肪酸和甘油，在 水解过程中会产生中间产物甘油单酯和甘油二酯。脂肪酶可以催化酯类化合物的分解、合成和酯的交 换，它具有化学选择性和高度的立体异构专一性，且反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶 的另一显著特点是：它只能在异相系统(即油一水界面)或有机相中作用，这不仅发展了“界面酶学”，也 促进了“非水酶学”的研究和深入。脂肪酶属于丝氨酸水解酶，且它含有相同的结构序列，G—X1一S— x2一G(G为甘氨酸，S为丝氨酸，X1为组氨酸，)(2为天冬氨酸)，它的三维结构对酶的催化作用影响很大。 就工业方面而言，大多数工业应用不需要制备纯酶，然而，纯化的程度会影响酶的利用率。传统的 脂肪酶纯化既繁琐又耗时，且终产量较低。丽工业上需要低成本、生产周期短、产量高和适应于大规模 生产的纯化方法，因此要用新的纯化方法来增加酶的产量和减少下游处理技术的步骤。脂肪酶具有疏 水性界面活性和非水系统活性，因而与其他酶纯化方法不同。近年来，一些新的纯化技术已应用于脂肪 酶的纯化，如膜处理、免疫纯化、双水相系统、反胶团系统等，通常这些方法应用在纯化前期，以增加酶的 产量。 脂肪酶具有广泛的应用价值，它在有机化学工业、去污剂工业、生物表面活性剂合成工业、油化学工 业、农用化学品工业、造纸业、营养业、化妆品工业、制药业等的生产中都有应用，这与脂肪酶合成新复合 物技术的迅速发展有关，从而扩大了脂肪酶的应用。本文就微生物脂肪酶的纯化方法及其应用领域进 行了阐述。 二、纯化方法 绝大多数脂肪酶属于胞外酶，其纯化步骤包括将含有酶的培养上清液通过过滤、硫酸铵沉淀或有机 溶剂提取等方法对样品进行浓缩。在有些报道中介绍TNNN得N的酶产量较高，因此这样的酶制品 可应用到一般的去污剂工业中。而对于某些应用，如在制药业中的合成反应，需要进一步的纯化。脂肪 酶具有疏水性，大量的活性位点位于其疏水表面。近几年内，疏水层析已经得到广泛的应用。脂肪酶的 486 以科学发展观促进科技创新(下) 纯化产品也可以从亲和层析中得到，亲和方法可以用在纯化前期，但由于其材料昂贵，通常在沉淀之后 选用离子交换和凝胶过滤。 (一)常用方法 1．沉淀法 通常在前期纯化过程中，粗酶液先用沉淀法进行分离，大约80％的纯化方法中60％用了硫酸铵沉 淀，35t)6用了乙醇、丙酮或酸(一般用盐酸)进行沉淀。脂肪酶活力的大小与所用硫酸铵溶液的浓度有 关，在处理大量材料时，硫酸铵沉淀对非蛋白物质的影响比层析要小。与其他方法相比，沉淀法通常可 得到87t％的酶，而其他方法只得到60％～70％的酶。 2．层析法 一般只用一种层析法不能达到要纯化的水平。选择纯化微生物脂肪酶的层析法取决于制备的粗酶 液，即使同一种粗酶液也要用不同的纯化方法，因此要用几种层析法对酶进行纯化。其中最常见的方法 是离子交换层析，常见阴离子交换剂DEAE纤维素，阳离子交换剂CM纤维素和强离子交换剂TEAE 纤维素，在脂肪酶纯化中，常用Q—Sepharose离子交换层析。纯化过程中，另一种常用的方法是凝胶过 滤，此外亲和层析、疏水层析(最常用的疏水吸附剂含有辛基和苯基官能团)和吸附层析(最常用的吸附 剂是羟基磷灰石)也可用于微生物脂肪酶的纯化。 若在纯化前期用亲和层析，则成本较高，因此在沉淀之后一般采用低成本的离子交换和凝胶过滤。 虽然凝胶过滤对蛋白的承载能力较低，但把它用在纯化前期或后期，可使纯化方法更加完善。 (二)现代纯化中常用的新