1.2基因工程的基本操作.规范.ppt

基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的获取 （2） （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成 （一）从基因文库中获取目的基因 1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因表达的计算 在真核生物中，对应的是 的碱基数 基因组文库的构建模式图 （2）反转录法（cDNA文库的构建方法） 以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。 思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？ （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。 思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 基因工程技术路线 （1）农杆菌转化法 ①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 ③转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 （2）基因枪法 适用于单子叶植物 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 适用于被子植物 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄蕊 雌蕊 2.将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中） （2）操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 3.将目的基因导入微生物细胞 思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？ 用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性 导入方法 受体细胞 微生物 动物 植物 受体生物 受精卵 体细胞 受精卵 细胞/个体 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注 射技术 用Ca2+处理成感受态细胞 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（　　）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 四、目的基因的检测与鉴定 检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ① 首先取出转基因生物的基因组DNA； （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； ③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。 （一）检测 基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 　 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定（个体生物学水平） 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ①方法: 分 子 杂 交 方法: 抗原-抗体杂交 ②过