Westernblot实验技术及常见问题分析陆挺关于印迹法印迹法.ppt

Western blot 实验技术及常见问题分析 关于印迹法 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体(NC、PVDF或Nylon膜)上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 关于免疫印迹检测 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 仪器与设备 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Bio-Rad公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司） Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白样品的制备 通过水溶液或有机溶剂制备总蛋白 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。 细胞裂解液： 50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 5mmol/L EDTA, 1%NP40，0.05% PMSF，2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin，pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 裂解方法的选择 裂解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1. 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。 2. 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 3. 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 4. 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。 细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，吸入1.5ml离心管。由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。 超声打碎染色体DNA，直至溶液不粘为止。 4℃，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS，如不能立即做，可将上清转入另一离心管-80℃保存。 蛋白样品的定量 Bradford法 其原理为：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 Lowry法 其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽链伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林酚试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 BCA法 是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。其原理为：蛋白质分子中的肽链在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS是一种离子性的表面活性剂，它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当SDS与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位)，而蛋白质结合固定比例的SDS之后，由于SDS带强负价，使蛋白质原先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density)，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 试剂 丙烯酰胺和N’-N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? SDS 配胶的Tris缓冲液（pH8.8、pH6.8） TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 凝胶浓度与蛋白分离范围 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转30－120min。 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 封闭 脱脂奶粉（5％，TBST配制） BSA（1％） Western B