第4章核酸规范.ppt

Southern杂交 Northern杂交 Western杂交 2、?? Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、?? Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用 4.5 核酸的分离、提纯和定量测定 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇（蛋白质 沉淀，DNA溶于水）。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇 4.5.1 DNA分离纯化 EDTA是DNA酶的抑制剂，防止细胞破碎后DNA被降解 酚使蛋白质变性，氯仿、异戊醇是沉淀蛋白 酒精是沉淀DNA，因为DNA溶于水，不溶于酒精。 4.5.1 DNA分离纯化 制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： ①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性； ②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活； ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) 4.5.2 RNA的分离 提取方法： 酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提。 胍盐/氯化铯浆细胞抽提物进行密度梯度离心 4.5.3 核酸含量的测定 2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm） 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 * * * * * * * * 4.2.5 DNA的三级结构 指DNA（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。 超螺旋是DNA三级结构的一种形式 A.真核细胞染色体的DNA念珠状三级结构 （H2A、H2B、H3、H4）2 B. 原核生物以及真核生物细胞器环状DNA的超螺旋三级结构 叶绿体中含有环状DNA 线粒体中含有环状DNA 细菌等原核生物 质粒 染色体 负超螺旋 正超螺旋 4.3 RNA的分子结构 核糖核苷酸通过磷酸二酯键相连形成的长链 RNA的类别 根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。 mRNA (信使RNA) 约占总RNA的5%。 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。 它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 – 核糖核蛋白体。 种类多、不稳定、寿命短、数量少 Messenger RNA tRNA (转移RNA) 约占总RNA的10-15%。 它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。 RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。 分子量小、稳定、寿命长 Transfer RNA rRNA (核糖体RNA) 约占全部RNA的80%， 是核糖核蛋白体的主要组成部分。 rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。 稳定、量大 Ribosome RNA RNA一级结构的特点 RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。其中 tRNA分子具有以下特点： 分子量25000左右，大约由70－90个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。 分子中含有较多的修饰成分。 3-末端都具有CpCpAOH的结构。 4.3.2 RNA的高级结构 RNA通常是单链线形分子，但可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），进而折叠（三级结构）。除tRNA外，几乎所有细胞的RNA都与蛋白质形成核蛋白复合物（四级结构）。RNA复合物如核糖体、信息体、信号识别颗粒、拼接体、编辑体等承担着重要的细胞功能。RNA病毒是具有感染性的RNA复合物 RNA中的碱基配对原则 A-U G-C