基因结构与功能规范.ppt

分子生物学第二部分 分子生物学研究的方法策略与技术支持 任课教师：肖尚英 基础医学院医学 生物化学与分子生物学研究所 第七章 基因结构与表达分析的基本方法 本章内容简介： 序列分析； 核酸杂交； 体外扩增； 核酸测定（存在分析——有无、多少）； 第一节 DNA序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis 核苷酸序列测定最早始于20世纪60年代，即Sanger和Brownlee等建立的RNA序列测定技术。 真正意义上的DNA序列分析方法，是在具有极高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)技术的基础上建立并发展起来的。通过电泳可以分离长度达300～500个碱基，而差别仅1个碱基的同系单链核苷酸序列。 70年代初，Sanger建立了第一种直接测定DNA序列的方法——加减法，并用该法测定了ΦX174噬菌体DNA的全长5375个核苷酸序列。1977年Sanger又建立了更为简便、精确的“双脱氧核苷酸末端终止法”(dideoxynucleotide chain termination method)测定DNA序列。这种方法迄今仍然是绝大多数实验室中最常用的DNA序列分析方法。 几乎在同一时期，Maxam和Gilbert于1977年建立了另一种快速测序的方法——化学降解法。这两种方法虽然原理不同，但是对DNA序列分析技术的快速发展都具有深远的影响。 此后，以双脱氧核苷酸末端终止法为基础，利用与光敏元件相连的计算机系统，建立了荧光DNA序列分析技术，实现了DNA测序过程的自动化。DNA序列分析技术伴随现代分子生物学的发展而不断完善，这项技术已成为生命科学研究工作者探索生命奥秘的重要工具之一。 一、双脱氧末端终止法 ATP、dATP和ddATP的结构示意图 DNA合成反应原理图 末端终止部位示意图 双脱氧末端终止法测序反应的基本原理和过程 1 末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影 二、化学降解法 化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。 在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。 然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 化学法测序实例 Sanger第一步：加入复制终止剂 荧光偶联法自动DNA测序结果 四、新一代DNA测序技术 自学 第二节 核酸分子杂交技术 Nuclic Acid Molecular Hybridization 杂交简介 1969年，Pardue等建立了细胞原位杂交技术。 1975年，Southern建立了检测DNA的southern印迹杂交技术。 1977年，Stark建立了检测mRNA的Northern印迹杂交技术。 随后，在液体介质中进行的分子杂交技术，如核酸酶S1保护分析法、RNA酶保护分析法、抑制性消减杂交等技术也得到了充分发展。 分子杂交是研究核酸的有力工具，在分子克隆、基因诊断、基因表达分析、核酸序列分析等方面发挥着重要作用。核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最广泛应用的技术之一，它的应用大大地推进了分子生物学的迅猛发展。 一、核酸分子杂交的原理 1.变性（denaturation） 2.复性（renaturation) 3.杂交（hybridization） 1.核酸的变性 维系DNA双股螺旋的主要力量是氢键和疏水作用力。其中氢键是一种次级键，能量较低，因此，加热、强酸和强碱、有机溶剂（如甲醛、甲酰胺）及高盐等条件都可破坏DNA二级结构，DNA的双螺旋结构解旋，两条链完全解离，但未破坏其一级结构，此过程称为DNA的变性(denaturation)。 实验室中常用的使DNA变性的方法是加热。由于GC碱基对之间形成3个氢键，A=T碱基对之间为2个氢键，因此DNA分子中G≡C配对越多，解链所需的温度就越高。 当核苷酸摩尔数相同时，A260值大小有如下关系： 单核苷酸单链DNA双链DNA，这种关系称为DNA的减色效应(hypo-chromic effect)； 在DNA变性过程中，随着碱基暴露程度的增加（分子内的共轭双键暴露程度增加），其溶液的A260值增高的现象称为增色效应(hyperchromic effect)； DNA变性从开始到完全解链，只是在一个相对窄的温度范围内完成，在这个温度范围内，A260值达到