抗肿瘤疫苗pVHN的大规模纯化制备研究.pdf

其他论文 在本研究中利用毕赤酵母表达的中国林蛙抗菌肽基因，抗菌肽属于一类小分子肽类，用 普通的SDS—PAGE电泳检测不到，实验经TdcineSDS—PAGE检测后在8KD左右有目的表 达带。用抑菌实验在上清中就可以检测到所表的的目的蛋白，且有抑菌活性。有关其对肿瘤 细胞的抑杀作用的实验将在以后的文章中进一步讨论。 参考文献黯 抗肿瘤疫苗pVHN的大规模纯化耕备研究 孛雪梅金宁一牵霄李囊 (军科院十一所基固工程重点实验室长春’苫袜省130062) 擅耍肿瘤pVHN疫苗具有潜在的临床治疗肿瘤的应用前景．大规模纯化制备是质粒DNA应用于基因 治疗的关键步骤．质粒的大规模蟪化流程包括：发酵，离心收集细胞，碱性飘解，Qph∞盼xL富集质粒， 浓缩，Source 15Q精制质粒．所得质粒DNA中的残留蛋白含量，RNA含量，残留蕾体基对姐DNA含量 均符合质量标准． 关键词质粒纯化制备肿瘸 本实验室前期研究表明HN基因具有明显的抗肿癯作用，提示其走肉临床应用的可能性 很人。为促进pVHN疫苗的产业化，本研究_摸索7一条以色谱技术为核心的肿瘤pVHN疫 苗制备工艺，并根据国外推荐的方法及标准在体外评判其质量，为pVHN疫苗的大量生产 奠定技术基础。 另外，近年来，质粒DNA载体系统倍受青睐，2010年其所占市场份额将达450亿美元。 经核准应用质粒DNA作为基因治疗载体的研究项目已占基因治疗项目总数的25％。但是作 为载体，质粒DNA的细胞转染效率远不及病毒载体，到达细胞的质粒DNA中能进入细胞 核，并最终得以表达的只占l％，因此所需质粒的剂量应在毫克级，工业化生产则应达到千 克级。探索一个在实践上可行的、能制备高纯度和高均一性质粒DNA的工艺，对以DNA 为药物的产业化研究也有十分重要的实践意义。 1材料与方法 1．1质粒、菌株和培养基 pVHN，抗肿瘤疫苗。E．coliJml09，克隆载体的宿主菌，本室保存。LB培养基(pH7．5)： 1 g，YeastExtract0．5 Tryptone g，NaCll ml，高压蒸汽 g，调pH7．0，加蒸馏水定溶至100 灭菌20min。制备平板时加入1．Sg的琼脂粉。发酵基础培养基：胰蛋白胨5g，L，．酵母浸 4 粉5g，L，甘油5ml／L，KH2P044g／L，K2HP04·3H20g／L，Na2HP()4-12H207g／L， 1．2 0．2 g／L，NH4C1g／L．发酵补料基质：甘油170ml／L，酵母浸粉71g／L，蛋 (NH4)2S04 白胨71 5．7g／L。 g／L，MgS04·7H20 1．2仪器设备和试剂 XL，Source 阴离子交换色谱填料为QSephrose 15Q，均购自PharmaciaBiotech公司。 2．6x30cm色谱柱和1．6×20cm均购自上海华美层析设备厂。高速低温离心机和高速常温离心 纳科仪科技有限公司。HD-2000型和酸蛋白检测仪购自上海嘉鹏科技有限公司。横流泵和 机分别购自绍兴市卫生医疗设备制造有限公司。发酵仪器，多功能自控发酵罐购自B．Braim Biotech internation公司。恒温摇床购于哈尔滨东联电子技术公司。 1．3细菌发酵 大肠杆菌感受态的制备按文献【l】方法进行．将质粒pVHN转化之。按20L规模发酵，发 酵方案参照文献【l】。加入4L质粒pVHN种子液和卡那霉素(50“g／m1)，开始进行发酵培 ．。660．． 第六届理事会第二次会议■苏拳专业委员会2006年会议论文集 养。培养4小时左右，待溶氧值上升时，开始流加补料基质，流速为220ml／hr，调节搅拌速 度、空气流量和压强，使溶氧(DO)值保持在30％左右。当pH．(7．0时．随后加入25％氨 水，使pH值维持在7．0左右。发酵温度始终保持