抗骨桥蛋白单链抗体库的构建、筛选和抗体的体外功能学研究.pdf

生物技术 抗骨桥蛋白单链抗体库的构建、筛选和 抗体的体外功能学研究 彭玲 上海第二军医大学肿瘤研究所，上海，200433 摘要 目的：通过噬茵体展示技术，筛选与骨桥蛋白特异性结合的单链抗体。方法：用骨桥 蛋白免疫小鼠，构建单链抗体库，从中筛选特异性结合的抗体，并进行真核表达。结果：构 建了库容量为lxl08的单链抗体库，筛选得到了4株与骨桥蛋白特异性结合的噬菌体单链抗 Fc连接，进行真核表达，其中2株单链抗体IAl2和2H8在体外 体。将单链抗体与人IgGl 能够抑制肿瘤细胞的贴壁、迁移等功能。结论：本研究成功构建了抗骨桥蛋白单链抗体库， 并筛选得到与骨桥蛋白特异性结合的单链抗体． 关键词肿瘤学；噬茵体展示；骨桥蛋白；抗体 肝癌是严重危害我国人民生命健康的重大疾病，肝癌手术切除后，仍有一半左右的患者出现肿瘤的转 移、复发。深入研究肝癌细胞转移的机理有助于阐明肿瘤转移复发的分子机制，了解促进转移的信号传导 通路，寻找抑制转移的有效作用环节，能够为新药研制和临床治疗提供更有效的阻断靶点，提高肝癌病人 的生存率。 肝癌细胞转移过程中发挥了至关重要的作用。近年来在各国研究小组共同努力下，OPN促转移信号通路领 域不断有新的报道，从不同的角度对其促肿瘤细胞转移功能的主要方面进行了解释，OPN信号通路在促进 肿瘤细胞转移方面的重要调控作用，已经成为国际肿瘤转移研究领域的研究热点。 转移糖蛋白信号分子，在骨骼组织、肾脏组织、大脑组织、腺体表皮细胞、血管平滑肌细胞、活化的巨噬 细胞对细胞外基质的降解、细胞迁移和细胞的抗凋亡能力，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要 的作用。 通过噬菌体抗体库技术[61，可以构建针对OPN蛋白的免疫抗体库，通过重复几轮“吸附一洗脱一扩增” 的过程，从中筛选得到抗OPN蛋白的单链抗体。抗OPN单链抗体能特异性结合OPN蛋白，在体外能够 抑制肝癌细胞的贴壁、移行等与肿瘤的转移相关的生物学功能，为抗OPN抗体的体内功能学研究奠定了 基础。 1材料与方法 1．1材料 I、NotI等限制性内 HCCLM3细胞(以下简称LM3)惠赠于复旦大学汤钊猷教授并由本所保存，Sfi 切酶、T4 245 中国科协第四届优秀傅士生学术年会论文集 为上海生工公司合成，重组噬菌体抗体系统试剂盒购自Amersham公司。 1．2 hOPN的构建、表达和纯化和小鼠免疫 l。2，l hOPN和hOPN．Fc的构建、表达和纯化 vector连接，转化TGlTSS感受态细胞，挑取克隆 的条带，用琼脂糖电泳分离，并纯化回收。与pGEM．T h收上清，以离子交换层析柱进 进行测序。将hOPN转入毕赤酵母表达载体pPICZo【，甲醇诱导表达，48 行纯化，SDS—PAGE电泳鉴定蛋白表达。 1．2．2 hOPN免疫小鼠 处死小鼠取脾脏。 1．3噬菌体抗体库的构建和筛选 1．3．1噬菌体抗体库的构建 (1)7I物合成 根据文献【71设计小鼠全套抗体引物。 (2)RT-PCR扩增VH和VL基因 PCR扩增得到scFv的基因。 分别用琼脂糖电泳分离，并纯化回收。通过overlapping (3)噬菌体抗体库的构建 将scFv基因产物分别用SfiI和Not I消化，经琼脂糖电泳分离，纯化回收；与同样酶切回收的噬菌 5E进行连接反应，转化TGlTSS感受态细胞。取适量菌液稀释后，铺于SOBAG平板 粒载体pCANTAB 30℃过夜培养计算库容量，其余菌液以甘油分装冻存于．80℃。 1．3．2噬菌体抗体库的