色谱基本原理讲义.ppt

HPLC的特点和实际应用 1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右 HPLC法中分离条件的选择 2. 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。 3. 流动相及流动相的极性 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 选择流动相时应注意的几个问题： （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 第四节 凝胶渗透色谱(GPC) Gel Permeation Chromatography 一种新型的液体色谱，1964年，J. C. Moore首先研究成功。 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。 现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。 介绍 GPC以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、 具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；聚合物在分离柱上按 分子流体力学体积大小被分离开. 浓度检测器 solvent solution 体积大的分子先被淋洗出来 体积小的分子后被淋洗出来 (1) 测定原理 淋出体积：自试样进入色谱柱到淋洗出来，所接收到的淋出液的体积，称为该试样的淋出体积Ve。 当仪器与实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量越大，其淋出体积越小。 分子量越小，分子的体积越小，在流动过程中，不仅会从载体间较大空隙通过，还会从载体内部的小孔通过，经过的路程长；而体积大的大分子量的分子只能从载体间的空隙通过，经过的路程短，所以最大的分子会最先被淋洗出来。 (2) 体积排除机理 溶质分子的体积越小, 其淋出体积越大. 这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应, 其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定, 分离完全是由于体积排除效应所致, 所以GPC又被称为体积排除色谱(SEC， Size Exclusion Chromatography) GPC曲线 淋出体积代表了分子量的大小--M； 浓度响应代表了含量--W(M) GPC曲线就是聚合物的分子量分布曲线 浓度响应 淋出体积或淋出时间 W(M) M 大 小 (3) 级分分子量的确定 直接法：在测定淋出液浓度的同时测定其粘度或光散射。 间接法：采用一组分子量不等、单分散的样品（标样），分别测定其淋出体积与分子量，从而标定色谱柱分离的分子量与其淋出体积间的关系----分子量-淋出体积标定曲线。 分子量-淋出体积标定曲线 Ve logM A B C D V0 logMa logMb 一般而言，分子量与淋出体积间具有如下关系: 当分子量大于Ma时, 曲线如何? 当分子量小于Mb时, 曲线如何? 色谱柱的分离范围: Mb~Ma M1 M2 M3 M4 M5 Ve V1 V2 V3 V4