包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程.doc

包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程 一、包涵体包被抗原制备： 在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA板。 完成包涵体的制备和洗涤流程。 按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。 注： 每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的Buffer A溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的Buffer A溶解（使用前混合，1.97 ml Buffer A加入0.03 ml 20％的SKL贮存液）。 抗原稀释：使用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。 DMSO溶解的用CBS稀释4倍。 加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。 二、包涵体包被抗原浓度的确定： 1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。在ELISA板每孔加入100μL CBS。将100μL抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL液体弃去。 注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的Buffer A做对照。 2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。拍干！ 3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。弃去孔内溶液，用PBST洗3次，拍干！。封闭不彻底会导致假阳性！ 4、稀释阳性血清：在本实验中，傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做1000倍稀释。 5、加样：将100μL稀释好的血清加入上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1-2小时。用PBST洗3次，拍干！。 6、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100μL。37℃孵育不超过1小时，PBST洗涤3次，拍干！。 7、加底物液显色：各反应孔中加入100μL TMB（避光），37℃ 10-30min显色。 注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。 8、终止反应：于各反应孔中加入50μL 2M浓硫酸。 9、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”号表示。也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 10、结果分析：观察阴性对照是否也发生反应；选择检测阳性的最高稀释倍数前3-4孔的稀释度作为最佳包被浓度。例如，阳性血清如果前8孔为阳性，那么以后检测时抗原可以做24-5稀释后包板为宜。 三、包涵体包被ELISA板检测未知抗体： 1、稀释抗原：按照前期实验结果，用CBS稀释抗原。每孔加入100μL抗原稀释液。 2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。拍干！ 3、封闭：加入300μL 5%脱脂乳，37℃温育2小时或4℃过夜。弃去孔内溶液，用PBST洗3次。拍干！封闭不彻底会导致假阳性！ 4、加样：将25-100μL 细胞上清或者待检血清加入上述包被孔中，置37℃孵育1-2小时或4℃过夜。用PBST洗3次，拍干。（根据实验设计，同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔） 5、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100μL。37℃孵育不超过1小时，PBST洗涤3次。拍干！ 6、加底物液显色：各反应孔中加入100μL TMB（避光），37℃ 10-30min显色。 注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。 7、终止反应：于各反应孔中加入50μL 2M浓硫酸。 8、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”号表示。也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 计算公式：（待测样OD－空白OD）/（阴性对照OD－空白OD）。大于2.1可判读为阳性。 试剂