5.1DNA的粗提取与鉴定讲解.pptVIP

5.1 DNA的粗提取与鉴定 课题目标 课题难重点： DNA的粗提取和鉴定方法。 一、基础知识 提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 二、DNA的溶解性曲线解读：P54 1）在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低； 2）在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小； 3）当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 （一）利用该特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。 （二） DNA不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。 （三）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶:水解蛋白质，对DNA没有影响。 ②高温:大多数蛋白质不能忍受60－80°C，而DNA在80°C以上才会变性。 ③洗涤剂:溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。 试剂： （四）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。 沸水浴 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 三、实验设计 P 55 （一）实验材料的选取 思考：原则上选什么材料？P55 (1)选择含有DNA的生物材料。 (2)选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 例:鸡血细胞溶液 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液。 1.选动物细胞还是植物细胞？ 答：蒸馏水是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。搅拌的作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA（第一次析出） 讨论1：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 搅拌的作用？P55 动物细胞破碎较易 加入一定量的蒸馏水 （第一次） ， 同时用玻璃棒搅拌， 过滤后收集滤液即可。 2.方法: 植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜。 P55 3.植物(洋葱)细胞和动物细胞提取DNA的区别 讨论2：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？P55 答：洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放； 食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 讨论3：如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响？P55 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 （三）去除滤液中的杂质 P55 讨论4：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：除DNA外可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。P55 方案一: 在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L， 加蒸馏水（第二次） 调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L， 再用2mol/LNaCl溶液， 溶解DNA、除去不 溶杂质 第二次析出DNA。 溶解DNA 讨论5：方案一的原理是什么？ 方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案一的原理是：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。 方案二是利用木瓜蛋白酶分解蛋白质杂质，从而使提取的DNA与蛋白质分开。 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 讨论6：为什么反复地溶解于析出DNA，能够 除去杂质？P55 用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度是DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解于析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多中杂质。 （四） DNA的析出与鉴定 P56 1.DNA的析出 加入何种溶液： 出现什么现象： 与滤液体积相等冷却的酒精（体积分数为95 ％） 白色丝状物 P56 加入酒精的目的： 使DNA丝状物析出。提取含杂质较少的DNA。 酒精溶液 2.DNA的鉴定 P56 （步骤如下） ⑴ 两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml（目的是溶解DNA） ⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物 ⑶ 各加入二苯胺试剂4ml(二苯胺试剂的配制 P57） ⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min ⑸ 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色 变化 (6)观察现象： 溶解DNA丝状物的溶液变为蓝色。 四、操作提示 P56 1、以血液为实验材料时，加柠檬酸钠(防止血液凝固)。 2、 加入洗涤剂后，动作要轻、柔和，否则容易产生大量的泡沫。 3、加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓