第二章功能标记开发与定位概要.ppt

第二章 功能标记开发与定位 第一节 功能标记的概念与种类 第二节 功能标记开发 第三节 功能标记定位 第一节 功能标记的概念与种类 DNA标记多态性分子基础示意图 分子标记在染色体上的分布 1.1 功能标记的概念 又称诊断标记，是基于生物功能已知的引起表型变异的基因内部序列多态性位点开发的分子标记。前提是目标基因的生物学功能已经明确。 1.2 功能标记的种类 1.2.1 SRAP标记 Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性。 原理：利用独特的引物设计对ORFs 进行扩增， 上游引物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。 因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。 1.2.2 SRAP标记程序 1 引物设计 上游引物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。 2 反应体系及条件 反应体系：20μL 30 ng DNA 模板, 引物各0.3 μmol/L, dNTPs 200 μmol/L, 1× PCR buffer, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。 反应条件： 94℃变性5 min, 1 个循环; 94℃变性1 min, 35℃复性1 min, 72℃延伸 1 min, 5 个循环; 94℃变性1 min, 50℃复性 1 min., 72℃延伸1.5 min,35 个循环; 72℃延伸 5 min 3 产物检测及图谱分析 4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 特点 共显性标记系统 多态性强 DNA需要量少 简单且花费少 标记分布均匀 缺点：若未利用扩增区域序列的任何信息，则产生的标记是随机分布的，严格地说，不是功能标记。若针对某一特定基因设计SRAP引物，则标记为功能标记。 1.2.3 TRAP标记 Target Region Amplified Polymorphism，目标区域扩增多态性，或靶位区域扩增多态性。 原理：是利用生物信息工具和EST 数据库信息, 产生目标候选基因区多态性标记。TRAP技术采用两个18 核甘酸引物产生标记, 一个为固定引物, 依据EST 序列设计; 另一个为随机引物, 针对外显子和内含子的特点, 设计为分别富含GC 或AT 核心区的任意序列。 1 引物设计 TRAP技术采用两个18 核甘酸引物产生标记, 一个为固定引物, 依据EST 序列设计; 另一个为随机引物, 针对外显子和内含子的特点, 设计为分别富含GC 或AT 核心区的任意序列。 2 反应体系及条件 反应体系：20μL 40 ng DNA 模板, 引物各0.25 μmol/L, dNTPs 200 μmol/L, 1× PCR buffer, 15 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。 反应条件： 94℃变性5 min, 1 个循环; 94℃变性1 min, 35℃复性1 min, 72℃延伸 1 min, 5 个循环; 94℃变性1 min, 50℃复性 1 min., 72℃延伸1.5 min,35 个循环; 72℃延伸 5 min 3 产物检测及图谱分析 6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.2.4 PCR-DGGE标记 基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳标记。 原理：根据功能基因结构域基序单核苷酸多态性设计引物进行特异扩增，然后将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。 PCR 程序 巢式或半巢式PCR：touch dowd 94 ℃变性4 min ; 退火20 个循环(94 ℃ 1 min , 65～56 ℃ 1 min ,72 ℃ 1 min , 2 个循环降1 ℃); 延伸10 个循环(94 ℃1 min ,55 ℃ 1 min ,72 ℃1 min); 续延伸，72 ℃ 6 min. 图谱分析 针对16s rDNA结果 葡萄糖262磷酸脱氢酶( G6PD) 　急性白血病胸苷酸合成酶( TS) 1.2.5 其它功能标记 针对内含子扩增的： IFLP：内含子片段长度多态性 ISAP：内含子序列扩增多态性 SSCP-SNP：基于SNP的单链核苷酸构象多态性 针对启动子扩增的： PRAP：启动子区域扩增多态性 针对外显子扩增的： STS：序列标签位点 RGA：抗病基因类似序列 SSCP-SNP SSCP-SNP simple sequence repeat–functional domain marker (SSR-FDM) 与水稻籽粒长度高度相