第二章生物制药工艺学技术基础选编.pptVIP

第三节 生物技术药物制造技术基础 补充知识—PCR技术 聚合酶链式反应简称PCR （Polymerase Chain Reaction）：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。 步 骤 模板DNA的变性: 模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸: DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 引物：引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。 常用的引物设计软件：Oligo 6 ； Primer Premier 5.0 引物设计原则： 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 3.引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃ 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8. 5′ 端和中间G值应相对较高3′ 端较低 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 PCR反应系与反应条件 PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 标准的PCR反应体系： 　　10×扩增缓冲液 10ul 　　4种dNTP混合物 各200umol/L 　　引物 各10～100pmol 　　模板DNA 0.1～2ug 　　Taq DNA聚合酶 2.5u 　　Mg2+ 1.5mmol/L 　　加双或三蒸水至 100ul PCR反应特点 PCR反应的特异性决定因素 ： ①引物与模板DNA特异正确的结合 ； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 探针 是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。 当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据探针的种类，可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。 cDNA文库（cDNA library ） 含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。 以以特定的组织或细胞 mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 构建cDNA文库的作用： cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。