碱性磷酸酶的分离纯化鉴定讲义.ppt

碱性磷酸酶的分离纯化 有机溶剂分步沉淀法 分离纯化的一般程序 选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定 AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中）， 原理： 操 作 一、取材及匀浆 取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍） 二、提取 加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过滤，留上清。计体积。 三、分离纯化 1、50％丙酮沉淀AKP 加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀， 加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。 （取0.1ml留作B液，稀释10倍） 2、30％乙醇溶解AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml 2000rpm×5min，留上清（记录体积） 3、60％乙醇沉淀AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml 3000rpm×5min，留沉淀， 加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。 （取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍） 4、33％丙酮溶解AKP 每ml溶液中加入0.33ml丙酮 2000rpm×5min，留上清（记录体积） 5、50％丙酮沉淀AKP 每ml溶液中加入0.36ml丙酮 3000rpm×15min，留沉淀， 5ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀 （D液，不稀释） 四、分析及鉴定 1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法） 2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法） 3、比活性及纯化倍数计算 分光光度法（Spectrophotometry） 根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorption spectrometry）。 不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来 （一）基本原理 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。 1、光的基本知识 紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm） 红外分光光度计（760－1000nm） 2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律 A ＝ K·L·C 吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D ) K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。 对比法进行定量分析 A样 = K · L · C样 A标 = K · L · C标 A样 A标 K · L · C样 K · L · C标 C样 C标 C样 = A样· C标 / A标 单色光、平行光（λmax） 溶液均匀、清澈、无散射 溶液性质稳定，比色皿中无化学反应 适用于稀溶液（A 0.2-0.7） Lambert—Beer定律的适用范围： 溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。 参比溶液的选择 基本组件及常见分光光度计 分光光度计的使用 1. 打开电源预热15分钟 2. 选择波长（ λmax ） 3. 光标指向Trans 4. 打开光门，调节0％；关上光门调节100％ 5. 重复4一次 6. 将光标指向ABS 7. 读数 磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 苯酚 + 磷酸盐 碱性 苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 铁氰化钾 红色醌式化合物 AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法 单位（ml） 空白管 标准管 A B C D 各阶段稀释液 酚标准液（0.1mg/ml） Tris-醋酸镁 复合底物液 / / 0.1 0.1 0.1 0.1 / 0.1 / / / / 0.1 / / / / / 3 3 3 3 3 3 酶活性单位 （U/ml）= A样 A标 ×0.1 ×稀释倍数