革兰氏染色1重点.ppt

革兰氏染色 丹麦医生C.GRAM发明的染色方法，通过染色后，它将细菌区分为两类，即：最终染成紫色的革兰氏阳性菌，用G+表示和被染成红色的革兰氏阴性细菌。 革兰氏阳性菌及阴性菌细胞壁结构示意图 请各班班长在试验结束后安排同学打扫卫生，重新布置台面。 谢谢 * * 实验一 细菌的革兰氏染色 一、细菌革兰氏染色 一）实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二）实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。按照细菌对染色反应的不同，可以分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类，两类染色反应的不同，表示它们的细菌组成物质性质上的差异，也表明它们生理上的差异。革兰氏染色法对于细菌的分类鉴定以及生产应用与医学诊断上都具有重要意义。 其方法要点是；细菌先经草酸铵结晶紫染液处理，用媒染剂处理后，再用酒精脱色，最后用番红复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被酒精脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性细菌；如果细菌被酒精脱色而被番红染成红色，则称为革兰氏阴性细菌。 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材： 1、菌种：大肠杆菌、白色葡萄球菌 2、染色剂：革兰氏染液 3、接种环、载玻片、酒精灯、洗瓶、显微镜、双层瓶、擦镜纸等 四、实验方法 1、制片 涂片——干燥——火焰固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟、水洗； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗。（关键步骤） 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗。 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 图6 无菌操作过程 图7 涂片、干燥和热固定 图8 革兰氏染色程序 1、结晶紫染1min 2、水洗 3、碘液媒染1min 4、水洗 5、乙醇脱色30秒 6、水洗 7、番红复染2min 8、水洗 9、吸水纸吸干 实验结果： 1、绘出大肠杆菌和白色葡萄球菌的革兰氏染色视野图，并指出哪种是革兰氏阳性菌，哪种是革兰氏阴性菌。 思考题： 1、涂片后为什么要固定？固定时应注意什么？ 2、革兰氏染色过程中，哪些操作是成败关键？为什么？ 附 油镜物镜的基本原理和使用方法 一、目的要求 学习掌握油镜的基本原理和使用方法 二、油镜物镜的基本原理 油镜物镜与其它物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不时隔一层空气，而是隔一层油质，称为油濅系，这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率是n=1.51，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生曲折，如果载片与物镜之间的介质是空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到曲折，发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样一来就降低了视野的照明度。 利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值口径，因为显微镜的放大效能是由数值口径决定的。。所谓数值口径，即光线投射到物镜上的最大角度的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积。 N.A=nsina 其中N.A为数值口径； n为介质折射率 ； a为最大入射角的半数 a越大，N.A就越大 图9 介质为空气（A）和介质为香柏油（B）时光线通过的比较 图10 物镜的光线入射角 显微镜的分辨率与数值口径成正比，与光线波长成反比。因此接物镜的数值口径越大，光波长愈短，则显微镜的分辨率愈大，被检物体细微结构愈能更清楚的区别出来。 实验器材： 显微镜、香柏油等 实验方法： 1、观察前的准备 2、低倍镜观察 3、油镜观察、