瓜蒌皮体外抗氧化作用精读.docxVIP

瓜蒌皮黄酮类化合物体外抗氧化作用研究氧化也称氧化作用或者氧化反应,是指有机物在反应体系中引入氧或脱去氢的作用。氧化作用与人体的很多症状紧密相关,如:衰老、心血管疾病等。而氧化作用的发生,很多是由于自由基的存在而造成的。人体内的自由基可分为:氧自由基和非氧自由基氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的95%,包括超氧阴离子(02-)、轻自由基(OH-)、过氧化氢分子(H2O2)、氢过氧基(H02-)、烷氧基(RO·)、烷过氧基(ROO·)、氮氧自由基(NO·)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、氢过氧化物(R00H)以及单线态氧(102)等,它们又统称为活性氧(reactiveoxygenspeeies,1ROS),都是人体内最重要的自由基;非氧自由基主要包括氢自由基(H·)和有机自由基(R·)等。因为自由基中存在孤对电子或不平衡电子,所以它们是极不稳定分子或原子。一般,活性氧往往产生于机体内的自然代谢或者机体外部化学物质的作用。活性氧可以通过链式反应攻击细胞内或者体液中的生物分子,如:蛋白质、DNA、脂质等,从而导致各种相关疾病的发生。本实验将就瓜蒌皮总黄酮提取物的体外抗氧化性能进行系统研究,为瓜蒌皮进一步开发利用奠定科学理论基础。1材料与方法1.1材料与试剂瓜蒌皮乙醇提取物无水乙醇、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、硫代巴比妥酸、三轻基氨基甲烷(Tris),(分析纯)国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁(分析纯)沈阳沈一精细化学品有限公司、盐酸(分析纯)沈阳化学试剂厂1,1-二苯基-2-苦基苯胁sigma公司 ，卵磷脂北京奥博星生物技术有限责任公司1.2主要仪器设备紫外可见分光光度计1.3试验方法1.3.1清除DPPH自由基的测定精确称取DPPH9.7mg,加入少量无水乙醇溶解后,以体积分数为95%的乙醇溶液定容至250mL,制成浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液取2mL已配制的DPPH溶液,分别加入1mL不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液,以95%乙醇补足到4mL,混匀,放置30min后,在517nm处测定样品吸光值As:,以95%乙醇为空白对照,测定Ac(李春阳,2006).以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照,按下式计算清除率及IC50清除率/%=(Ac-As)/Acx100式中:Ac一空白的吸光度As:一样品的吸光度以样品浓度与清除率作图,根据拟合方程求出清除率为50%时所需样品的浓度,即半数抑制浓度IC5o.1.3.2抗脂质体过氧化能力的测定1.3.2.1试剂的配制1、脂质体PBS分散系(LLs):3oomg卵磷脂溶解于3omL 10mmol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲液),冰浴震荡(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。2、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液:15gTCA,0.37gTBA,2.lmL浓盐酸依序放入1OOmL水中(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。1.3.2.2测定步骤分别于样品管中依次加入1mL卵磷脂溶液 (LLS)、lmL0.4mmol/L硫酸亚铁、1mL样品,混匀，避光,于37℃水浴60min,加入2mLTCA-TBA-HCl混合液,90-100℃水浴15min,迅速冷却,以30O0r/min离心10min,取上清液在535nm测定吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。参比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂,Vc为阳性对照(李颖畅,2008;莫开菊等,2006;张尔贤等,1996)。按下式计算清除率及IC50。清除率/%=(Ac-As)/Acx100IC50的计算同1.3.1。1.3.3还原力的测定取不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液1mL于试管中,依次加入2.5mLO.2mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5mL质量分数l%K3Fe(CN)6混匀,于55℃恒温水浴中温育2Omin后,迅速冷却,加入2.5mL质量分数10%的三氯乙酸混合后,以300Or/min离心1Omin,取上清液2.5mL,依次加入2mL蒸馏水和O.5mL质量分数0.1%的FeC13溶液,充分混合,静置10min后,于700nm处测定样品吸光度值As:,吸光度越大,表示还原能力越强。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。用蒸馏水作参比,Ve为阳性对照(陈留勇等,2004)。还原力=As-Ac1.3.4清除超氧阴离子自由基(·02-)的测定取4.5mLpH8.2的50mmol/LTris-Hcl缓冲液,4.2mL蒸馏水,混匀,于25℃恒温水浴中保温2Omin,取出后立即加入在25℃预热过的25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL(以10mmol/LHCl配制,