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Confidential 实时荧光定量PCR一般流程 LU Yang Application Specialist Gene Company Ltd 内容 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 实验应用目的 未知样品中目的基因绝对量 比较不同样品中目的基因相对表达量 比较不同样品中目的基因相对表达量 比较不同样品中目的基因相对表达量 检测未知样品基因型 检测未知样品中某种成分的存在与否 Thank you! 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化,从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化,从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化,从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化,从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化,从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 CT值取决于阈值 ,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小,模板DNA的起始拷贝数越多; CT值越大,模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小,模板DNA的起始拷贝数越多; CT值越大,模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小,模板DNA的起始拷贝数越多; CT值越大,模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小,模板DNA的起始拷贝数越多; CT值越大,模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ,阈值取决于基线,基线取决于实验的质量,CT值是一个完全客观的参数。CT值越小,模板DNA的起始拷贝数越多; CT值越大,模板DNA的起始拷贝数越少。 * Date | AB CONFIDENTIAL StepOne? and StepOnePlus? Real-Time PCR Systems ? 2006 Applied Biosystems 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 未知样品中目的基因绝对量:绝对定量 比较不同样品中目的基因相对表达量:相对定量 检测未知样品基因型:SNP分析 检测未知样品中某种成分的存在与否:存在/不存在分析 ……………… 不同实验应用,实验准备不同 标准品: 已知确切浓度,分子结构和目的基因类似 梯度稀释: 至少5个浓度梯度,必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复: 每一个梯度最好3个重复,保证统计学意义 标准曲线: 斜率和标准差必须要符合数学意义 不同实验应用,实验准备不同 内参基因:用于数据均一化 扩增效率比较: 比较内参基因和目的基因的扩增效率,以确定相对定量的不同定量模式 △Slope 0.1,使用相对标准曲线法 △Slope 0.1,可以使用比较CT值法 不同实验应用,实验准备不同 △Slope 0.1,使用相对标准曲线法 标准品:内参基因和目的基因,不需知道样品确切浓度 浓度梯度: 至少5个浓度梯度,必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复: 每一个梯度最好3个重复,保证统计学意义 标准曲线: 斜率和标准差必须要符合数学意义 不同实验应用,实验准备不同 △Slope0.1,使用比较CT值法 内参基因:数据均一化 数学公式:2- △ △CT 不同实验应用,实验准备不同 荧光探针:两种不同标记,不用两种不同基因型检测 不同荧光表明基因型的不同 不同实验应用,实验准备不同 IPC:阳性对照,检验反应体系工作与否 目的基因探针:荧光信号有无判断存在与否 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 实验应用方案:基本流程 目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对 GeneBank或者文献查找 实验应用方案 引物和探针设计 遵循引物设计的一般规则,特别是多重反应的应用 根据自身情况确定荧光探针的种类 遵循所选探针设计的一般规则 BLAST比对确认引物特异性 实验应用方案 荧光报告基因的选择 根据自身仪器的性能 根据自身实验条件 尽可能选择相对成熟的荧光报告基团:FAM,VIC等 选择高品质引物探针合成商 实验应用方案 标准品制备(标准曲线法) 新鲜标准品 遵循所有标准品制备原则 实验应用方案 退火温度 热启动 引物浓度 引物和探针的纯度 镁离子浓度 模
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