用P．pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析.pdfVIP

34 生 物 技 术 2013年23(1) 用 P．pastoris表达 L一阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析 陈丽萍 ，崔艳艳 ，张爱联 “ (1．海南大学农学院，海南 海I=1570228；2．中国热带农业科学院热带生物技术研究所， 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海南 海 口571101) 摘要：目的：用毕赤酵母表达L一阿拉伯糖异构酶。方法：用PCR法扩增大肠杆菌的L一阿拉伯糖异构酶基因，构建含L一阿 拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K—ai。通过电转法将pPIC9K—ai转化毕赤酵母 GS115基因组。先筛选出 高G418抗性的克隆，然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L一阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌 GSll5(pPIC9K— ai)。结果：在甲醇诱导下，摇瓶发酵GS115(pPIC9K—ai)3d，分泌表达L一阿拉伯糖异构酶32mg／L。结论：毕赤酵母表达的L一 阿拉伯糖异构酶具有转化D一半乳糖为D一塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K—ai)发酵液能转化D一半乳糖生成30mg D一塔格糖。 关键词：L一阿拉伯糖异构酶；毕赤酵母 ；基因表达；酶活性；D一塔格糖 中图分类号：Q786 文献标识码：A doi：10．3969／j．issn．1004—311X．2013．O1．010 ExpressionofL—．ArabinoseIsomerase inP．pastorisand ItsEnzymeActivityAnalysis CHEN Li—ping ．CUIYan—yan。．ZHANG Ai—lion (1．CollegeofLifeScienceandAgriculture，Hainna University，Haikou570228，China； 2．InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology，ChineseAcademyofTropicalAgricultural Sciences／Key LaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTorpicalCrops，MinistryofAgriculture，Haikou571101，China) Abstract：Objective：UsingPichiapastoristoexpressofL—arabinoseisomerase(L—ai)．Method：L—arabinoseisomerase(L—ai)gene wasamplifiedfrom theE colichromosomebyPCR techniqueaccordingtotheL—aisequenceandcloneddirectlyintoplasmidpPIC9K to obtainingofP．pastorisexpressionplasmidofpPIC9K —aiwhichwasthen transformedintotheP．pastorisofGS115 byelectroporation method．Astrainwithhigheranti—G418andbetterexpressionwasusedasengineeringstrainnamedofGS115(pPIC9K—ai)．Result：Af- terathreedaysfemrentationtheGS115(pPIC9K—ai)inshakingflaskwithmethanolasinductor，32mg／LofL—ArabinoseIsomerase (AI)wassecretedinthefemrentationbroth．Conclusion：TherecombinantL—AIexpressedheterogeneouslyinPpastorisshowedactivity ontransfomr L—AIasD—Tagatose．Eachlit