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果树分子生物学发展综述 摘要：本文总结了园艺产业中适合不同果树病毒的检测方法、真菌病毒的简介、下一代测序技术的应用、Micro RNA的简介。 关键词：果树病毒检测 真菌病毒 高通量测序技术 引言 果树组织中病毒含量一般较低，难以检测，这对病毒检测方法有较高的要求。与传统的果树病毒检测方法相比，病毒核酸检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优势，因而成为果树病毒检测发展的方向，特别是以PCR技术为基础的检测方法发展迅速。由于实时PCR、多重PCR和NASBA技术进一步提高了检测效率和检测速度，因此发展前景较好，特别是利用荧光实时PCR和NASBA同时检测多种病毒是发展的主要方向。 近年来由发现真菌病毒导致病原菌低毒力 ，对植物病原真菌dsRNA病毒研究较多，研究最深入的真菌病毒是产黄青霉的病毒，真菌病毒的侵染可使食用真菌遭受灭顶之灾。如双孢蘑菇的枯死是一种危害性很大的IaFranceDisease引起的病毒病害 ，表 现为双 孢蘑 菇 畸型 ，菌丝溶化 ，不再产生蘑菇而减产。病毒的侵染也会造成香菇菌丝生长缓慢，略带黄色，袋装菌块上形成秃斑，有时产生不正常的子实体和孢子。然而某些感染病毒的植物病原菌表现 出低毒力 ，对植物的致病性降低。如感染了杆状病毒的Botrytiscinerea对水果和花卉的侵 染力明显减低 ，感染病毒的栗疫菌低毒力菌株等已成为生物防治病原真菌的重要手段，使意大利的栗树林得以恢复 ，我国在栗疫菌病毒的研究也取得一定成果。研究低毒力相关的dsRNA与其他真菌病毒dsRNA 的关系 ，将对真菌病毒 dsRNA 的基础研究以及如何调控病原真菌 dsRNA 对寄主的毒力提供依据。欧美等地用低毒力菌株进行生物防治取得了明显的效果，给国内果树病毒防治提供了一种生防的新思路。 高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 同时，高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种测序技术：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）。在植物研究领域，因为高通量测序技术的出现，使得基因组测序、转录组测序、microRNAs 探查等不再是难事，极大地推动了植物分子生物学研究进程。 在多细胞生物的基因组中都存在一类非编码RNA基因,能够产生长度约为22个核苷酸的小分子RNA ,称为micro RNA (miRNA) ,具有调节其他基因表达活性的功能。miRNA的发现,为我们理解复杂的基因调节网络开辟了新的空间。 一、果树病毒检测技术 1.1.利用PCR技术检测果树病毒的研究进展 PCR技术可以快速地对病毒进行鉴定，其灵敏度高于血清学方法，而且也可以灵敏地检测维管束病毒。PCR引物的合成及长期保存也比较方便。利用PCR技术，对多数植物病毒都可以稳定地进行检测，而在果树病毒的检测中，有较多检测结果受季节影响的报道。为了提高检测的稳定性和检测效率，免疫捕获PCR(ImmunocapturePCR,IC—PC）、 印迹捕获PCR(Print—capture PCR，PC—PCR)、巢式PCR(Nested-PCR)、PCR-ELISA，实时PCR(Real．Time PCR)等一些新的PCR技术已被应用于果树病毒的检测中。 IC—PCR利用抗血清捕获病毒粒子后，再进行PCR扩增，解决了病毒含量低和核酸纯度低影响扩增的问题。尽管IC．PCR需要抗血清，且需要免疫捕获步骤，但对于草莓、樱桃等难以分离优质核酸树种的病毒检测有独特的优势。在检测SMYEV的研究中，常规PCR无扩增产物，而IC．PCR对不同的引物都可以很好的扩增。由于香蕉基因组中整合有香蕉线条病毒Banana steak virus，BSⅥ的部分核酸序列，因此，利用IC．PCR检测香蕉中的BSV可以避免假阳性。PC—PCR是利用蛋白混合物或抗血清在滤纸或膜上捕获组织中的病毒后再进行PCR反应。操作简