表达破伤风毒素C片段的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四斑奎国发酵工程学术讨论套论文集 表达破伤风毒素C片段的减毒鼠伤 寒沙门氏菌的构建与鉴定． 刘婷，焦新安’，潘志明，黄金林 (扬州大学．缸苏扬州225009) 摘要：为构建表达破伤风毒素C片段基园的减毒鼠伤寒沙门氏茵，将编码破伤风毒素c 片段的基因插入到asd+的组成型表选载体pYA3333，转化asd基因宪变的EcoliX6212，获 得重组质粒pYA3333一TetC，再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌，构建成表达破伤风毒 了该重组苗表达的蛋自与预期的目的蛋白一致。重组苗X4550(pYA3333一TetC)的稳定性试 验表明，在体外培养100代后，随机挑选的重组茵落空部都能生长，重组苗X4550(pYA3333一 致。动物试验证明该重组曹是安全的，破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用，为进一步 的疫苗研发奠定了基础。 关键词：破伤风毒素；鼠伤寒沙门氏苗，重组 破伤风毒素是一种由破伤风芽孢梭状杆菌产生的强烈的神经毒素，由1315个氨基 酸组成，可被木瓜蛋白酶裂解成由两个二硫键连接的轻链和重链。根据毒索在体内的作 用，将其分为A，B、C三个部分(分子量均为50kD左右)。经研究C片段在动物体内没有 毒性．并且保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，具有良好的免疫原性。 以减毒沙门氏菌作为载体构建双价活菌苗，是目前研制新型菌苗的重要途径之一。 表达外源性抗原的减毒沙门氏菌经口服、鼻腔、直肠免疫动物后，均能诱导宿主产生强烈 的特异性免疫应答．包括全身和粘膜体液免疫应答．以及1型和2型辅助T细胞应答和 随后的细胞因子表达。在利用pET一30a(+)载体构建了高效表达破伤风毒素C片段基 因的重组大肠杆菌的基础上，本研究拟采用平衡致死系统重新构建能在减毒鼠伤寒沙门 性，为进一步研发有效的破伤风口服基因工程疫苗奠定了基础。 1材料与方法 1．1材料 菌X4550(cya-crp—asd—R+M+)为Dr．Roy 联系作者：E—majl：jiao@yzu．edu．cn． 刘婷等：表达破伤风毒素C片段的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 237 构建。 内切酶NcoI及SalI，DNA凝胶回收试剂盒购自Takara公司；T4DNA连接酶购自 美生物工程公司。 1．1．3实验动物：ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心 1．2方法 I酶切消化后，采用低熔点琼脂糖法回收目的片段，与经同样的限制性内切酶酶切的载 X4550感受态细胞。1．2．2 用电穿孔法转化S．typhi 验：按参考文献43进行。 中生长，并且将这100个样品进行PCR鉴定。 1．2．4 制作生长曲线。同时将空载体菌X4SS0(pYA3333)作为对照。 1．2．5免疫保护试验：于ld，14d，28d，6只小 鼠口服活菌苗X4550(pYA3333一TetC)，每只 1×10。cfu；5只小鼠静脉免疫活菌苗X4550 (pYA3333一TetC)，每只5×106cfui5只小鼠 腹腔免疫活菌苗X4550(pYA3333-TetC)，每 @i(三|；(夕＼岁 只5×108du}对照组口服活菌苗X4550 (pYA3333)。所有口服免疫组在试验前口服 适量NaHC03，以中和胃酸。各免疫组在二 免、三免后7d采血，以破伤风类毒素包板，间 接ELISA测定小鼠血清中抗Tet—C抗体效 ③ 价。末次免疫后lod以20LD50剂量的破伤 圈1质粒pYA3333-TetC的构建流程图 风毒素腹腔攻击，观察5d，记录结果。 2结果 2．1重组质粒pYA3333一TetC的构建 238 第四次全国发酵工程学术讨论会 X6212，用不含DAP的琼脂平板筛选转化子。碱 连接酶的作用下进行连接，转化E．coli 裂解法抽提质粒后，