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HRM 技术在植物育种中的应用 摘要： HRM(High Resolution Melting,高分辨率溶解曲线)，作为国际上成熟的点突变扫描与检测 技术，在人类疾病相关基因鉴定、植物诱变育种基因突变检测及基因分型等多个领域都得到 了广泛的应用。现在我们就重点关注一下HRM 技术在植物育种中的具体应用。 正文： 现代农业技术领域中，分子遗传育种在植物育种中发挥着越来越大的作用。HRM 之所 以作为分子育种中常用的突变检测、基因分型技术，是由于HRM 不受突变碱基位点和种类 的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点。 ? HRM 在植物诱变群体中的突变扫描 为了获得优质种质资源，常采用物理诱变、化学诱变等技术处理植物样本，而这些诱变 技术通常会导致点突变、小片段插入缺失突变等。在获得诱变群体后，针对特定基因设计特 异性引物，采用HRM 技术高通量筛选诱变群体，获得突变个体。由于HRM 技术速度快、成 本低、通量高，所以非常适合植物诱变群体的点突变扫描。 在异源六倍体小麦中，Dong 等第一次应用HRM 分析EMS(Ethylmethane Sulfonate ，甲基 磺酸乙酯)诱发的点突变群体，实现同时扫描小麦SSII-A 、SSII-B 和SSII-D 。他们在SSII-A 、SSII-B 和SSII-D 的C 末端保守区域上相似性很高的一段序列(532bp 含17 个SNPs)设计引物，分几 个片段(长度约100～250bp)可同时扩增三个基因，然后对小麦农家种Ventura 的EMS 诱变群 体进行HRM 分析。对140 个样品的未知突变进行扫描，片段ABD6-1 由于其G+C 含量高 (63.72%)、固有的SNP 较多(5 SNIPs)及二级结构造成的影响，有15 个样品出现差异的熔解峰， 结合其他手段进一步证实该群体扩增出的ABD6-1 片段有8 个突变体，而HRM 分析扫描出 其中的7 个；片段ABD2-9 中有6 个突变体而HRM 扫描出其中的5 个；片段ABD12-22 包含 的6 个突变体均被HRM 扫描出。可见，HRM 扫描未知突变的灵敏度较高(83.3%～100%)， 且常受到G+C 含量、二级结构、DNA 样品纯度等因素的影响。 ? HRM 在基因分型中的应用 目前主流高通量SNP 基因分型方法包括 SNP 芯片分型技术、KASP （Kompetitive Allele Specific PCR ）竞争性等位基因特异性PCR 技术等，特别适合于需要筛选多个SNP 位点且群 体量大的样本群体。除此之外，HRM 分析应该是仅次于以上两种高通量筛选技术的最佳选 择。HRM 分析应用于植物基因分型，不需要特异性序列探针，在PCR 反应后直接对DNA 双 链逐渐升温变性熔解，然后通过光学检测系统采集荧光信号变化并绘制溶解曲线，软件会根 据曲线准确将野生型、杂合型、纯合型样本区分开来。（如图） HRM 实验的成功，除了周密的实验设计外，一款合适的仪器也是获得准确实验数据必 不可少的保证。根据HRM 实验原理，对于仪器来讲，绝佳的温度均一性和高数据采集密度 是保障实验成功的核心所在。由于点突变引起的解链温度差异很小，一般要求仪器的温度均 一性小于0.2 度才能检测出突变引起的温度差异，所以仪器的温度均一性越好，仪器的检测 灵敏度就会越高。此外，仪器需要具备高的数据采集密度，才能实时地记录整个过程的温度 变化。美国Illumina 公司推出的个人创新型Eco 实时荧光定量PCR 系统，以其卓越的性能深 受广大科研工作者的青睐。对于HRM 实验，Eco 荧光定量PCR 系统除了具备以上两点要求 外，最大的优点在于速度非常快且操作简便，专业的软件分析功能更有助于突变个体的鉴别， 支持一键数据导出，方便实用，是实验室HRM 实验的最佳选择！ 若想了解更多HRM 的应用及Illumina Eco 实时荧光定量PCR 系统，欢迎联系我们！（设 置一个链接，以便客户能留下信息）