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酵母表面表达环糊精糖基转移酶及其性质研究 王占坤，祁庆生术，王鹏 山东大学生命科学学院微生物国家重点实验室 济南，邮编：250100 E-mai 电话：0531真：0531 l：gigi翌g墨b皇旦g堕；鱼望：皇垒型：里旦 常见的CD由6-8个葡萄糖组成。环糊精分子呈锥形的圆环状，它的内侧是由-CH一 基及葡萄糖苷键的氧原子组成，呈疏水性；而它的外侧开口处一端是2，3一位羟基， 另一端是6一位羟基，因而CD外侧呈亲水性；由于其“内疏水，外亲水”的特殊分 On 子结构，使得CD能与多种有机小分子形成特殊结构的包合物(Inclusi Complexes)，改变配体物质的物理化学性质(溶解性，稳定性等)。此外，CD的上、 中、下层原子都不同，没有对称元素，即具有手性，因此在作为分离填充物时可 以分离手性物质。由于CD具有的以上性质，已经在食品，医药，化学，化妆品， 环保，农业，工业领域得到广泛应用。 催化环糊精形成的酶命名为1，4．a．D．葡萄糖基4．a．D．转移酶或者环糊精糖基 转移酶，属于淀粉酶家族(CGTase，EC2．4．1．19)。作为Q一淀粉酶家族的一员，环糊 精糖基转移酶除了能够进行水解反应外，还催化转糖基反应，包括环化反应，歧 化反应和开环反应。在歧化反应和水解反应中，除了产生环糊精寡糖外，还产生 葡萄糖和麦芽糖。而它们都是CGTase的抑制剂，最终会影响环糊精的产量。1998 年Lima等人曾经把环糊精的合成与酵母发酵培养结合起来，在他们设计的反应条 件下，酵母消耗掉了环糊精合成过程中产生的葡萄糖和麦芽糖等抑制剂：同时， 酵母产生的乙醇又能与环糊精形成包合物，这样又减少了产生环糊精的抑制作用， 进一步增加了环糊精的产量。但是由于细胞和酶同时反应，酶的损失很大，而且 后处理非常困难，因此，在工业生产上没有得以实施。 我们利用酵母表面表达技术建立了一种新的环糊精生产的平台，在这个平台 中，环糊精糖基转移酶固定表达在酵母细胞表面，成为固定化酶。固定化有环糊 精糖基转移酶的酵母细胞能够直接利用淀粉作为底物生产环糊精，省略了淀粉的 糖化水解过程；同时，在环糊精生产过程中产生的葡萄糖和麦芽糖能够被酵母利 用，从而解除了葡萄糖和麦芽糖对环糊精糖基转移酶的抑制作用。使环糊精的产 量从20mg／ml提高到25mg／ml。 固定化酶的最适酶反应温度还是50℃，但酶在高温和低温的稳定性增加；最 适酶反应pH值也从6变到了9。尤其重要的是，环糊精糖基转移酶的产物专一性 增加了，B环糊精的比例从64％增到了75％。在50℃，pH9的条件下带有酶的工程 化酵母酶活达到1．88个单位每毫升培养细胞(一个单位的酶活定义为每分钟转化 l毫摩尔B环糊精的酶量)。在酵母培养条件下，即在30℃，pH7的条件下，酶活较 低，但经过一段时间后产物总量要比同等量的纯酶产生的环糊精要高，而且产物 分离时只需离心去除酵母菌体，不需要去除酶，减少了生产步骤。 163 参考文献： toapplication·Appl· gene glucanotransferase：from Qi，Q．·，Zimmerman，W(2005)Cyclodextrin Microbi01．Biotechn01．66：475—485． ontheCell of Glucanotransferase