Fusion primer and nested integrated PCR.ppt

Fusion primer and nested integrated PCR （FPNI-PCR） 一、PCR技术简介 1.定义 2.原理 二、TAIL-PCR 1.定义 TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）交错式热不对称PCR，又叫巢式PCR，是一种染色体步移技术（Genome Walking）。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。 2.原理 是根据已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与经过独特设计的退火温度较低的兼并引物（可以设计多条，AP1、AP2、AP3……）， 进行热不对称 PCR 反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称 PCR 反应，一般通过三次巢式 PCR 反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。 TAIL-PCP原理图 1）优点 广泛应用在 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，克隆完整的基因序列 等； 2）缺点 花费大量时间 产生大量的非特异性扩增产物 3.评价 一种快速高效的新的染色体步移方法，该技术比目前报道的染色体步移方法，耗时要少得多，理论上比应用广泛的TAIL-PCR更有效。 三、Fusion primer and nested integrated PCR （FPNI-PCR） （a）FPIN-PCR原理 （b）TAIL-PCR原理 1.原理 FPNI-PCR以一系列引物为核心，FSP是由兼并片段的5’末端和已知序列片段的衔接子的3’末端连接而成 Cycling parameters and PCR conditions for FPNI-PCR The effect of annealing temperature during the low stringency PCR cycles of the primary PCR step 2.FPNI-PCR参数的设计与优化 3.FPNI-PCR与TAIL-PCR的对照实验