胚胎干细胞与胚胎工程.ppt

胚胎干细胞 与组织工程 胚胎干细胞的定义 1、全能干细胞 2、多能干细胞 3、专能干细胞 一、胚胎干细胞研究进展 （一）1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡的ICM （inner cells mass)获得鼠的ES细胞，同年美国的Maryin用条件培养基获得鼠的ES细胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遗传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和嵌合特性的分析。现在已对猪牛羊等大动物的胚胎干细胞进行了一系列建系和分化研究。 （二）国内的研究概况 1、1987年上海细胞生物学研究所获得小鼠ES细胞。 2、1996年北京大学尚克刚建立了小鼠的ES细胞系并对其特性进行了系列研究。 3、近几年赖良学、常万存、徐令、钱永胜、窦忠英等建立了兔、猪、牛等大动物的胚胎干细胞系或类胚胎干细胞系 4、山东农业大学生物工程实验室获得了鸡的胚胎干细胞并用其制备了嵌合体。 （三）1995年Thomson从恒河猴的囊胚中分离克隆建立了第一个灵长类的细胞系。 1998年Thomson利用自愿捐献的体外受精的胚胎免疫法除去透明带。在鼠胎儿成纤维细胞饲养层上获得了5个细胞系。连续培养5个月传到32代仍可继续生长。同年Gearhart和shamblott利用流产胎儿的原始生殖细胞建立了人的胚胎干细胞系（EG）随后澳大利亚、新加坡、以色列等国也获得了人的ES细胞 二、ES细胞生物学特性 （一）ES细胞的一般特性 1、胚胎干细胞的基本特点----发育全能性能分化出属于三胚层的分化细胞。 2、可以在体外无限扩增。 3、具有种系传递功能。形成嵌合体的能力 4、在体外可以进行基因工程处理：如转基因，基因打靶，基因诱变 (二）ES细胞的形态 1、体外培养的ES细胞无论有无饲养层的条件下培养，细胞都为圆形或卵圆形，呈集落生长时，细胞间紧密堆积，无明显的细胞界限，形似鸟巢。 2、细胞消化分散后的单个细胞体积小、亮、圆形、核大、胞浆少，一个或多个核仁 （三）ES细胞的核型 （四）ES细胞呈现高的端粒酶表达活性 （五）人ES细胞具有表达早期胚胎表面抗原（SSEA，stage-specific embryonic antigen）的特性 （六）ES细胞的体内分化 1、在免疫缺陷小鼠体内分化 三胚层结构或畸胎瘤 2、将ES细胞注入囊胚中可以形成形成嵌合体动物 1984年bradly 获得了注射ES细胞的嵌合体鼠 （七）ES细胞的分化潜能 在不同的饲养层和诱导条件下ES细胞可以分化为以下六种细胞： 1、造血细胞 ES细胞的拟胚体在体外可分化为卵黄囊血岛样结构分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞。ES细胞分化为造血细胞是可重复和高效的，除血清外不需其它因子，类似于胚胎发育过程。 2、内皮细胞和血管 3、心肌和肌细胞 拟胚体在一定条件下培养数天可产生自动收缩的心肌细胞 二甲基亚砜和肌肉专一性调节因子MyoD转染ES细胞结合可诱导ES细胞分化为骨骼肌，并形成肌管。 4、神经细胞 维甲酸可提高贴壁培养的ES细胞转化神经细胞，并表达特异蛋白-nestin,并在实验中用来作供体移植入Huntingson’s疾病模型大鼠体内，可治疗该种疾病。 5、脂肪细胞和软骨细胞 ES细胞在二甲基亚砜、胰岛素和三碘甲腺原酸的联合作用下可分化为脂肪细胞；的塞米松可诱导携带ROSA-geo基因的ES细胞转化为软骨细胞。 三、ES细胞的来源 （一）哺乳动物动物胚胎干细胞 1、来源于ICM 2、来源于生殖嵴的原始生殖细胞 （二）人胚胎干细胞来源 1、利用人工授精遗留的胚胎或流产的胎儿。 2、将人的成熟的细胞核和移入人卵细胞培养至囊胚期分离ES细胞 3、将人的细胞核移入其它动物卵细胞以获得ES细胞 4、将人的细胞核移入ES细胞内利用ES细胞的胞浆诱导表达ES特异基因 四、ES细胞的培养 （一）ES细胞培养的基本条件： （二）ES细胞的培养 （三）ES细胞的鉴定 1、克隆及形态学观察 2、体外分化试验 3、体内分化和嵌合体制备 五、ES细胞的开发和利用 （一）动物ES开发和利用方向 1、用ES细胞研究哺乳动物自身胚胎发育过程、时序调控和组织功能研究。 2、寻找调节胚胎细胞定向分化的关键因子诱导ES细胞定向分化的条件。