ConditionalReprogrammingcell(CRC)综述.pptx

Conditional Reprogramming cell(CRC) 茵冠生物 技术部 ——谢亮 内 容 CRC的研究应用 CRC、ESC和IPSC区别与比较 CRC技术的特点 CRC细胞的制备操作 CRC技术细胞基简介 当前实验室利用CRC培养细胞存在的问题 一、CRC技术基本简介 1、背景 美国乔治城大学医学院细胞重编程中心实验室主任华人教授刘学锋，于2012年发现及命名的细胞技术，揭示了分化细胞能够在一定条件获得干细胞样特性，使细胞永生化，具有转化医学、个性化医学和活的生物银行的未来的前景，将会为肿瘤个体化诊疗、临床研究以及抗癌药物研发带来具大的影响。该技术已在NIH、哈佛大学、耶鲁大学、杜克大学、斯坦福大学、麻省总医院、Mayo医学中心、Novartis等近百所世界一流大学和研究所研究与应用，并且不断在PLOS ONE、STEM CELL、RESEARCHGate等著名期刊网站进行研究报道。 2、定义 在体外细胞培养物中，通过添加rock 抑制剂（Y-27632)，和辐射处过的饲养层细胞（一般为成纤维细胞），在不改变基因型的情况下使已分化的细胞再次获得干细胞样特性，使细胞永生化，具有无限增殖功能，当条件去除时，干细胞重新转变成初始分化细胞，表现出专一性分化潜能。 Y-27632:丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的小分子特异性抑制剂，作用：调节细胞骨架的重构，激活转录因子，促进细胞增殖。 3、两个条件 1）ROCK 抑制剂 - Y-27632 ROCK抑制剂 均为小分子有机化合物。 作用于催化结构域的 ATP 结合位点，有松弛平滑肌的作用。 ROCK抑制剂有几十种，但目前上市使用有：Y- 27632 、法苏地尔、 羟基法苏地尔。 ROCK抑制剂化学结构 Y-27632化学结构 2）饲养层细胞 定义：指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。饲养层细胞大部分使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)。 作用：模拟体内环境，提供实验细胞更好的营养及促进细胞间的联系；饲养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性，是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。 二、CRC的制备操作 1、实验前准备工作 1）试剂 增殖培养基、Y-27632试剂、分化培养基、胰蛋白酶 2） 设备与耗材 移液管、T75培养瓶、离心管、孔板、移液枪、生物安全柜、CO2培养箱、 倒置显微镜 3） 细胞 子宫颈上皮细胞、辐射处理过的小鼠j2成纤维上皮细胞 2、制备操作（子宫颈上皮细胞为例） 手术得到目标细胞； 细胞分离后，加入辐射处理过的鼠成纤维饲养 层细胞的F培养基中（含10μG Y-27632)； 细胞每3-4天进行传代，快速扩增； 胰蛋白酶消化处理，收集； 细胞纯化，去除饲养层细胞，获得较纯的目标细胞 传代：CRCs（4.2*10^5,T75培养瓶）与新鲜辐 射的成纤维饲养层细胞按1：10接种，培 养3 天；或CRCs（2.1*10^5,T75培养瓶） 与新鲜辐射的成纤 维饲养层细胞按1：20 接种， 培养4天； 3、质控检测 细菌 真菌 支原体 内毒素 细胞活率及细胞倍增次数 核型分析（检测是否发生基因型改变或者致瘤） 细胞表面抗原 诱导分化 三、CRC的特点 操作简单，快速，少量的细胞可大量增殖（可低于4-6个细胞） 谱系定向，专一性分化，初始细胞重编程为干细胞样细胞后，只能分化为该初始细胞 可逆性，分化细胞与干细胞样细胞可相互转化 基因型稳定，不会发生基因型改变，并且不具有致瘤性 高表达整合素α6、β1, ΔNp63α, CD44, hTERT, 核β-环蛋白；低表达 Sox2（胚胎干细胞关键蛋白）, Oct4（干细胞因子）, and Nanog（胚胎干细胞关键蛋白），后者在胚胎干细胞及诱导多能干细胞ips 中高表达。 CRC细胞表面抗原表达情况定量分析 四、CRC、ESC和IPSC区别与比较 ESC IPSC CRC 细胞来源 卵细胞和精细胞结合形成受精卵，受精卵细胞分裂，形成