protocol With PGM Template OT2 200 Kit only..docVIP

Ion one touch With Ion?PGM??Template?OT2?200?Kit?only. 打开疝气阀门，检查总压力表不低于500psi，少许打开终端阀门，压力表调到30psi，待稳定后关上终端阀门。1psi=7kpa.室温在-25 oC。 打开Ion one touch电源，检查软件版本是否为 Diluate Library, 将E. coli DH10B Control 00 Library 1ul稀释到260ul H2O中。或者将实验样品稀释到。通常Qubit测得N ng/ul的M kb的文库的为N*1.515/M (nM)。 丢掉上次反应用过的。 T”open lid”,安装Recovery route和Recovery tubes。 安装新的Amplification Platedisposable?tubing?到the?pinch?valve。 安装disposable injector，直至上下按动时有响声，并检查是否安装正确。 添加Oil tube至1/2体积，注意Oil用之前的瓶子需要上下颠倒次Ion OneTouch? Sipper Tube。 检查Recovery solution是否有SDS析出，如果有沉淀可以30 oC温浴至清澈上下颠倒次Recovery tube至1/体积。Ion OneTouch? Sipper Tube。 倒掉废液瓶的废液，并重新旋紧废液瓶。Oil waste tray（勿全部拔出），检查是否有oil，如果没有或者少许oil，推回去即可。如果有多余的oil，处理掉之后并联系工程师。 配置扩增反应液。 Ion PGM?Template OT2 00 Reagent Mix第一次使用时，从-20oC取出解冻（解冻之后要储存在4oC）震荡混匀后离心，置于室温。Ion?PGM??Template?OT2?200?PCR?Reagent?B放置到常温，不要放到4oC。打开后半年内摇用掉。打开后震荡1分钟，轻甩后放置到常温。如果发现有沉淀，75 oC温浴1分钟，震荡1分钟，轻甩后放置到常温。 Ion PGM?Template OT2 200 Enzyme Mix弹动混匀后，轻轻离心，放置到冰上。Library震荡5秒钟后离心，放置到冰上。Ion PGM?Template OT2 200 Ion Sphere?Particles放到常温。 依次加入下列成分至1.5mlLoBind??Tube中，保持在常温状态下。 震荡5秒混匀混合液，轻甩2秒后放到常温。 Ion PGM?Template OT2 200 Ion Sphere?Particles（ISP）快速震荡1分钟，轻甩后，吸取100ul到扩增反应液。 震荡5秒混匀混合液，轻甩2秒后放到常温，在15分钟内开始反应。 安装Ion?PGM??OneTouch?Plus?Reaction?Filter?Assembly。 取一个新的Ion OneTouch? Plus Reaction Filter Assembly，倒置到15ml离心管上。其中单独的一个管口为进样口。将准备好的扩增反应液快速垂直震荡5秒钟，快速离心2秒钟或者用手轻甩，避免产生气泡。然后快速用1ml枪头上下吹打样品几次，接着垂直加入到进样口，最后的气泡不必加入。 接着加入1.5ml的Ion OneTouch? Reaction Oil，分两次加，要换枪头，枪头保持垂直并缓慢打入，不要破坏油水界面。 翻转时保持进样口在左侧，顺时针旋转，保持进样口一直保持在油相中。对准Ion OneTouch? Instrument上面的3个孔安装。 运行Ion OneTouch? Instrument，run，Ion?PGM?Template?OT2?200?Kit，按照提示检查每步的任务直至开始运行，运行时间约小时。运行完毕后，样品在Ion OneTouch? Instrument上停留不超过1小时，但是一旦按下next离心，就必须立刻处理。 回收template-positive ISPs。 运行结束后，按下Next，样品离心分钟，丢掉Recovery Router，小心取出2个Recovery Tubes，注意沉淀的方向，用1ml枪头轻轻的吸取上清，留下约50ul，用200ul的枪头吹打混匀后转到一个新的标记的1.5ml离心管，此时不要丢掉枪头和Recovery Tubes。用1ml Ion OneTouch? Wash Solution依次清洗Recovery Tubes后转移到标记的1.5ml离心管中，刚才未丢弃的枪头也需在标记的1.5ml离心管中吹打，彻底洗掉枪头上残留的ISP此产物可以放置3天内使用。 接着15500g，离心