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实 验 四、 核酸浓度、纯度的检测 DNA的电泳检测 实 验 目 的 ? 原理： ? 掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的原理。 ? 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理 ? 技术技能 ? 掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的步骤和计算方 法。 ? 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作 1、DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测 实验原理 ? 在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 ? DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常 数）。 ? 琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在 电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。 ? 在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于 由DNA分子的大小与构型。 DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。 700bp 900bp 电泳方向 相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。 质粒DNA的分子构型 (a)松弛线性的DNA（L） (b)松弛开环（OC） (c)超螺旋（cccDNA） 三种构型的质粒的电泳模式图谱 影响电泳速率的因素 1.DNA分子量的大小 2. 琼脂糖凝胶的浓度 3. DNA的分子构象 4. 电压 5. 电泳缓冲液的离子强度 1、琼脂糖 2、TBE缓冲液: 临用时用水稀至0.5×TBE( pH8.0～8.2) 3、核酸电泳的指示剂 ? 溴酚兰：在碱性液体中呈紫蓝色 ? 二甲苯青：在碱性液体中呈蓝色 琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2% 溴酚兰的迁移率： 与之相当的DNA大小 1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb 琼脂糖凝胶浓度 1% 1.4% 二甲苯青迁移率：与 之相当的DNA大小 2Kb 1.6Kb 在电泳中，溴酚兰和二甲苯青的迁移率与下列双链线性DNA片段相当： 试 剂 4、载样缓冲液(Loading Buffer) 注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液， 其作用是： ? 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加 样孔内 ? 在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度 和位置 ? 使样品呈色，使加样操作更方便 5、荧光染料(GoldView，GV) GoldView (GV) 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核 酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在 100ml琼脂糖胶溶液中加入5μl GoldView即可。在紫外透射光 下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。GoldView 不仅能染DNA，也可用于染RNA。 PCR扩增产物的检测 1. 琼脂糖凝胶的制备 ①根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度； ② 胶板的制备：胶槽置于水平支持物上（两侧封口）, 插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保 持1mm左右的间隙； ③ 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 20ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀； ④倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。 ⑤待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。 2. 加样：将下列样品在洁净的保鲜膜或一次性手套表面混匀， 用微量移液枪小心加入凝胶的样品孔中。 ① 8μl PCR产物 + 2μl 6×载样液 ② 8μl 质粒提取物 + 2μl 6×载样液 ③ 8μl pUC19 质粒 + 2μl 6×载样液(阳性对照) ④ 5 μl DL2000 Ladder Marker (DNA marker) ⑤ 5 μl λEcoR T14 Marker (阳性对照) 注：注意点样品要放阴极端！ 每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染； 注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 加样顺序 3. 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压 最高不超过5V/cm（按两极间距离计算出总电压） 。当 溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 (125V, 30min) 4. 观察和拍照 (1)在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜（全班共用一张保 鲜膜），赶去气泡，然后将胶槽内的胶块小心滑出至 样品台上面。 (2) 在300nm波长紫外透射仪下观察电泳胶板。DNA存