ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建解答.ppt

Exo III 介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建 答辩人：梁耀极 导 师：韩家淮 一、L I C背景 经典连接克隆方法的极限： 长片段进大载体难度大； 酶切位点有限，受酶切位点限制大。 带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复 L I C Ligation Independent Cloning LIC原理 载体和目的片段间，只要带有足够长的同源粘性末端（8bp），经退火，转化E.coil. 即可获得完整的质粒DNA 获得粘性末端 ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3’=5’的外切酶活性 获得5粘性末端 获得粘性末端 ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其具有3‘=5’的外切酶活性： 具有从平末端消化dsDNA的外切酶活性； 具有从5‘突出端消化dsDNA的外切酶活性； 不具有从3‘突出端消化dsDNA的外切酶活性。 获得5粘性末端 用ExoIII处理具有同源序列的载体和片段： Insert Vector Insert Vector (overlap) (overlap) ExoIII Anealing Insert Vector 在用ExoIII处理载体和片段，获得粘性末端的同时势必会出现两种不可避免情况： 1. Insert Vector Insert Vector Gap 2 Insert Vector Overhang (cohesive are different in length) (cohesive are different in length) Insert Vector 获得同源序列 用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获得带同源序列的目的片段和载体。 Vector Gene Gene 引物 我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？ 二、实验过程 用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的 PET 28a 100ng 4ul Gene-A3 100ng 1ul Ddw 4ul 转化、涂板 10ⅹExo Ⅲbuffer 1ul +Exo III 20units 室温 5min 5 个克隆 寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间 15h 条件优化一 4℃,60 minutes 条件优化二 25-50ng 载体和片段 条件优化三 Insert/Vestor≧2/1 最高效的克隆条件 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系； 4℃ 下反应1h； 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间； 保证目的片段和载体的摩尔比在2/1左右。 最高效的克隆条件 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的反应体系； 4℃ 下反应1h； 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间； 载体重建 pBKS pcDNA3.1 pcDNA6 pBOB-CMV 通用序列：（No-tag） GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC AGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC Kpn I Cla I EcoR I EcoR V Sal I BamH I Hpa I Stu I Xho I Bgl II Hind III Sma I Xba I Sac I N-terminal C-terminal 经改造的载体都带上了共有的序列 我们所获得的带通用序列的载体： pBKS-CS pcDNA3.1-CS pcDNA6-CS pBOB-CS pBKS-N- Flag pcDNA3.1-N-Fla pcDNA6-N-Flag pBOB-N-Flag pBKS-N-HA pcDNA3.1-N-HA pcDNA6-N-HA pBOB-N-HA pBKS-N-Myc pcDNA3.1-N-Myc pcDNA6-N-Myc pBOB-N-Myc pBKS-C-Flag pcDNA3.1-C-Flag pcDNA6-C-Flag pBOB-C-Flag pBKS-C-HA pcDNA3.1-C-HA pcDNA6-C-HA pBOB-C-HA pBKS-C-Myc pcDNA3.1-C-Myc pcDNA6-C-Myc pBOB-C-Myc 仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可同时将其接进不同的载体，并带上不同的tag