微生物 基因工程菌精要.ppt

酵母表面展示系统的类型 目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。 酵母表面展示与酶技术 酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用。 酵母表面展示与酶技术 利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。Katsumi利用α凝集素系统将来源于产黄菌属的 OPH 展示于酵母细胞表面，细胞荧光强度测量表明每个细胞表面可以展示 1.4×10 4 个 OPH 分子，酵母展示系统OPH酶活性较大肠杆菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，为有机磷化合物的脱毒提供了一种有效的生物催化剂。 表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞生物催化剂。 酵母表面展示系统与新药筛选 将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或突变体库进行筛选，能发现与这些未知功能的基因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质，有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导化合物。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵母双杂交技术相结合，将抗体的scFv 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到LexA的结合结构域( DB) 上，以His3和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达，可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的平台。 酵母细胞表面展示与生物吸附 环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可重复利用 利用表面展示技术能较好地解决这一问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其进行处理使之不断重复利用。 苏云金芽孢杆菌杀虫原理 产生芽孢时产生伴孢晶体 由几种晶体蛋白即δ-2内毒素组成 δ-2内毒素分为Cry和Cyt两类：Cry活体条件下只对双翅目幼虫有毒,离体条件下具广谱性;Cry分为4种,CryI对鳞翅目幼虫有毒, CryII对鳞翅目和双翅目均有毒,CryIII对鞘翅目有毒,CryIV对双翅目有毒。 天然苏云金芽孢杆菌作为杀虫菌的缺陷 苏云金芽孢杆菌存在的杀虫谱窄、持效期短等缺陷。严重影响了苏云金芽孢杆菌的实际应用。但与转基因植物相比，基因重组微生物具有研究快速、生产方便、应用灵活、害虫不易产生抗性等诸多优点。 从自然界筛选新的苏云金芽孢杆菌菌株 利用分子生物学的技