基因甲基化检测指导.docVIP

基因甲基化检测? 甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程. DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。 CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。 因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如甲基化检测与低剂量CT相结合）、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。 目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。 一. MSP实验流程： 基因组抽提； 基因组DNA定量； 重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以，需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率； 引物设计（每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物M，非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段），有时需设计巢式引物； PCR扩增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别扩增,此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度； PCR产物电泳； 电泳结果分析（定性即有无甲基化，半定量即甲基化程度高低）。 ? 图1：MSP PCR产物电泳图 二. qMSP实验流程：? 基因组抽提； 基因组DNA定量； 重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以，需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率； 引物和探针设计（每个基因设计一对引物和两条条探针），定量引物和探针的设计难度是比较大的，设计好的引物和探针既需要理论上的分析验证（软件），又需要通过实验验证和筛选，所以一个目的基因有时需设计几对不同引物和探针以供筛选； 标准品制备： 完全非甲基化DNA的制备：筛选合适的基因组DNA，确保其完全没有甲基化，作为阴性对照; 完全甲基化DNA的制备：用甲基转移酶对完全非甲基化的DNA进行甲基化修饰，目的是把DNA中所有的CG中的C甲基化，修饰后的DNA是完全甲基化的，作为阳性对照; 把A作为0%甲基化，B作为100%甲基化，对A和B进行不同比例的混合，形成梯度甲基化的标准品; 对C步的系列标准品进行Realtime PCR扩增，制备多个不同的标准曲线; 根据标准曲线的相关系数，对D步的标准曲线进行筛选，选择合适的标准曲线用于后续的实验. 6. PCR扩增：对实验样本进行PCR扩增，此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度. 7. Realtime PCR扩增：对实验样品进行定量PCR扩增，同时扩增标准曲线; 8. 结果分析：通过PCR结果可以直观的看出每个样本的甲基化程度（百分比）。 ? 图2a：qMSP技术原理 图2b：qMSP标准曲线 三. BSP（亚硫酸盐测序法）实验流程：? 基因组抽提； 基因组DNA定量； 重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以，需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率； 引物设计（每个基因设计一对引物，引物位置尽可能的避开DNA中的CG位点），有时需设计巢式引物； PCR扩增：对实验样本进行PCR扩增，此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度。 PCR产物电泳； 对目的条带进行切胶回收； 回收后的PCR产物连接克隆载体（T载体）； 转化E.coli H5α； 挑选阳性克隆测序； 测序结果分析：实验专业甲基化分析软件对测序序列进行甲基化分析，可以得到如下数据： A. 测序序列与目的序列的相似度（%）； B. C-T转化效率（%）； C. 目的片段中每个CG的甲基化情况（点状图）； D. 每个CG的甲基化率(%)； ? ??????????????????