CcdB分子生物学研究进展讲义.doc

学号 2007218018 昆明理工大学硕士研究生 综 述 专 业 微 生 物 学 姓 名 贾 卉 入 学 时 间 2007年9月 日 期 2009年1月8日 CcdB分子生物学研究进展 摘要：毒素-抗毒素系统广泛存在于质粒及大肠杆菌染色体中，在缺乏抗毒素的情况下，毒素通过作用于细胞内不同的酶，使细胞中毒，最终导致细胞死亡。本文综述了ccd系统及自杀基因ccdB的作用原理和机制。 关键词：毒素-抗毒素系统、Ccd系统、CcdB Key words: Toxin-antitoxin system, Ccd system, CcdB 毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin，TA）系统是一种可能与细胞生长阻滞或是细胞凋亡有关的系统。该系统最初发现存在于大肠杆菌F质粒上[1]，典型的TA系统由两个基因构成。两个基因分别编码一种稳定的毒素蛋白和一种不稳定的抗毒素蛋白，毒素对细菌有致死作用，而抗毒素通过与毒素形成复合体，中和毒素的毒性，使宿主菌能够存活。 TA系统主要存在于一些低拷贝质粒上，细菌分裂后，不稳定的抗毒素蛋白被迅速降解，不具有质粒的子代细菌就会被稳定的毒素蛋白杀死，这种作用称为分裂后致死效应（the post segregation killing effect，PSK），近一步研究发现在大肠杆菌的染色体上也存在TA系统，但染色体上的抗毒素蛋白对毒素蛋白并不能起到解毒的作用，只有依靠质粒上的抗毒素蛋白才能保证细菌存活，低拷贝质粒正是依靠TA系统的PSK效应，稳定在宿主中存在。 目前已知的TA系统包括7个质粒编码TA基因家族：ccd、mazEF、vapBC 、phd/doc、parDE、higBA和relBE[2, 3]。虽然TA系统在基因结构和调控模式上十分相似，但是每种毒素的作用原理却存在很大差异。CcdB和ParE通过使促旋酶失活抑制DNA复制，使细胞中毒。RelE通过切割mRNA，抑制翻译过程导致细胞凋亡。而HigB的作用机理目前尚不清楚。 1． Ccd系统 Ccd（control of cell division or death）为F质粒小F复制子上的一个组件，F质粒共编码三种TA基因系统[4]，Ccd系统[5]只是其中的一种，由CcdA和CcdB两个基因共同构成，也可以称为H、G或是letA、letB，分别编码两种小分子量蛋白：CcdA蛋白（8.7kDa）与CcdB蛋白（11.7 kDa）。CcdA蛋白易被Lon蛋白酶降解，在系统中起到解毒剂的作用，CcdB蛋白较CcdA蛋白稳定，是一种细胞毒素，在没有解毒剂存在的条件下，可以导致细胞凋亡。 2． CcdB CcdB编码一个101个氨基酸的蛋白（图1），能使DNA促旋酶复合体中毒，并抑制促旋酶的活性。 图1 CcdB蛋白二聚体的二级结构拓扑图[6] 红色的为5条反向平行的β—折叠，稍短的3条紫色的为翼型折叠，黄色为C端的α螺旋。 但是，当存在CcdA蛋白时，CcdB蛋白活性因为形成CcdA-CcdB紧密复合体而受到一定程度的抑制。 3. CcdB蛋白作用原理 3.1 促旋酶 促旋酶是一种在原核生物有机体中必须存在且高度保守的酶，属于拓扑异构酶II，大肠杆菌促旋酶作为一种罕有的拓扑异构酶，在ATP存在时，能够解除负超螺旋。大肠杆菌促旋酶为四聚体，由两个GyrA亚基（97kDa）和两个GyrB亚基（90kDa）组成。GyrA亚基有两个功能不同的结构域[7]，其中N-端结构域（59kDa）与DNA 断裂-修复有关，而C-端结构域（37kDa）为DNA结合结构域，与DNA折叠有关，整个GyrA亚基形成酶的催化中心，与DNA断裂—再接合反应有关。GyrB亚基同样由两个结构域组成，N-端结构域（43kDa）决定着促旋酶的活性，其作用是结合和水解ATP，C-端结构域（47kDa）的功能目前还不清楚[8]。 3.2 CcdB蛋白与促旋酶的相互作用 促旋酶通过GyrA亚基上的Tyr122共价结合DNA，并诱发DNA的断裂，断裂的DNA称为G-segment ，同时，另一条称为T-segment的完整DNA穿过G-segment的断裂处，释放到DNA-促旋酶复合体以外，G-segment在原断裂处重新被修复。正是通过这样的断裂—再接合反应，促旋酶不断地向DNA结构中引入负超螺旋，使基因的转录和复制能够顺利进行。体外实验证明：CcdB蛋白存在时，促旋酶GyrA亚基和CcdB蛋白直接结合，形成复合体（α复合体），CcdB蛋白对促旋酶水解ATP和促发超螺旋的能力没有影响，即对促旋酶没有毒性