第一章蛋白質的分離純化.ppt

第9章 酶促反应动力学 1、?? 酶活力与酶促反应速度 酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应 速度（一般测初速度）。 酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间 2、?? 酶的活力单位（U） 国际单位（IU单位）： 在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU）， 1 IU = 1μmol /min 国际单位（Katal, Kat单位）： 在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称1Kat单位（1Kat =1mol ·s-1） 1 Kat =60 × 106 IU 最适条件：最适温度（25℃或37 ℃）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。 底物浓度（1）通常很大，使酶饱和 （2）底物消耗≤5% 淀粉酶两种定义： A：1 g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。 B：l ml 2%可溶性starch ，在1h内液化所需的enzyme量。 1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。 A：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克enzyme制剂 B： 20/0.5×1000×60/10=240000u/克enzyme制剂 3、?? 酶的比活力 Specific activity 每毫克酶蛋白所具有的酶活力。 单位：U/mg蛋白质。 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。 一个酶的分离纯化分为4 步。 步骤 1 2 3 4 总活力（U） 6 4 3 2 总蛋白质（mg） 20 10 5 2 比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2 ? 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。 ?酶的纯化倍数： ?酶的回收率： ×100% 4、酶活力的测定方法 P336 分光光度法 荧光法 同位素测定法 电化学法 研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。 一、化学动力学基础 ㈠中间络合物学说 酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。 修正后的米式方程 Briggs和Haldane 1925 酶催化的反应中各成份的变化 由米式方程可知： 米氏常数Km的意义 （1）指出了[S]与V的关系 （2）指明了Km的定义 （3） Km不是ES的解离平衡常数，Km近似地表明E与S的亲和力。 Km大表明酶与底物亲和力弱，酶的催化活性低，Km小则表明酶与底物亲和力强，酶的催化活性高。 （4）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 （5）Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 （6）根据Km可判断酶的天然底物。 Kcat/Km represents actual catalytic efficiency because in vivo [S]/Km=0.01-1.0 ?? Km和Vmax的求解方法 1、?Lineweaver-Burk? 双倒数作图法 选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量： [S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时 1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。 [S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时， 1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。 其他作图法 2、??Eadie-Hofstee V—V/[S]作图法 P363 图9-11 3、Hanes-Woolf 作图法 P363 图9-12 4、Eisenthal 作图法 P363 图9-13 多底物酶促反应有 三种动力学机理 ★sequential reactions（single-displacement reactions):