第三章高效液相色譜法.ppt

* 第三章 高效液相色谱法 (HPLC) 第一节?? 概述 一．定义 以液体为流动相的色谱法，包括 1．经典液相色谱法：普通固定相、流动相常压输送 2．高效液相色谱法：高压输送、高效固定相、在线检测、 仪器化 二．HPLC与GC应用范围对比 GC：有机物的20% HPLC：有机物的80% （适合挥发性低、热稳定性差、 分子量大的高分子化合物及离子型的化合物） 三．HPLC的特点： ①适用范围广 ②分离性能好 ③分析速度快 ④流动相可选择性范围宽 ⑤灵敏度高 ⑥色谱柱可反复使用 ⑦流出组分容易收集 ⑧安全 第二节 高效液相色谱法分类与基本原理 一．HPLC的分类 二．基本原理 HPLC是将经典液相色谱法与气相色谱法的基本原理 和实验方法相结合而产生的，因此气相色谱法的基本概念， 保留值于分配系数的关系，塔板理论及速率理论，都可用 于高效液相色谱法，他们的主要差别在于流动相的不同。 （一）Van Deemter方程式 1．在GC中表现形式 H = A + B / u + C u --------填充柱 H = B / u + C u --毛细管柱 （A = 0） 2．在HPLC中 B = 2γDm Dm∝ T / η HPLC中的Dm比GC中的Dg小105倍 H = A + C u u↑, H↑, n↓ 第三节 各类高效液相色谱法 一．液-固吸附色谱法 （一）分离机制 k↑, tR↑, t’R ↑ 吸附色谱法是被分离的组分分子与流动相分子争夺吸附剂表 面的活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。 （二）固定相 1．硅胶 多孔硅胶，表面积大，容量大。如 （1）无定形多孔硅胶，塔板数2×104～5×104 m-1 （2）球形多孔硅胶，塔板数8×104 m-1 （3）堆积硅球，塔板数8×104 m-1 2．高分子多孔微球（有机胶） 分离机制：吸附或吸附、分配及空间排斥兼有 特点：柱效低（103m-1）, 但选择性好，峰形好 （三）流动相 烷烃（底剂）+ 极性调节剂----------二元、多元溶剂系统 溶剂极性大，洗脱力强，k↓, tR↓ （四）固定相和流动相的选择 1．固定相的选择：5～10μm, 比表面积大，含水量 小 2．流动相的选择：TLC（薄层色谱）为先导 二．液-液分配色谱法 （一）分离机制 1．正相液-液分配色谱法（NLLC） 流动相极性小于固定相极性-------正相色谱 正相洗脱, 极性小的先出色谱柱 流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓, tR↓ 2．反相液-液分配色谱法（RLLC） 流动相极性大于固定相极性-------反相色谱 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑, tR↑ 极性大的先出色谱柱 三．化学键合相色谱法 (BPC) （一）反相键合相色谱法（RBPC） 固定相：十八烷基键合相（ODS） 流动相：MeOH – H2O, CH3CN - H2O 1.?分离机制-------吸附、分配兼而有之 2.?流动相极性与容量因子的关系 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑, tR↑ （主要用于非极性化合物的分离） （二）正相键合相色谱法（NBPC） 固定相：氨基、氰基键合相 氰基与硅胶相似，比硅胶极性小（硅胶可以分离的都可用氰 基分离） 氨基键合相------适合于分离糖类物质 流动相：烷烃（底剂）+ 极性调节剂-----二元、多元溶剂系统 1．分离机制 诱导力、色散力、范德华力 2．流动相极性与容量因子的关系 流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓, tR↓ 极性小的先出色谱柱 （三）离子对色谱法（PIC或IPC） RPIC----反相离子对色谱法 （在极性流动相加入离子对试剂， 被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带 电的中性离子对，增加样品离子在非极性固定相中的溶解度， 分配系数增加，改善分离效果）， 1 离子对试剂：分离酸性或带负电荷物质，选择铵盐离子对 分离碱性或带正电荷物质，选择烷基磺酸（硫酸）钠 2 分离机制 离子对模式说 流动相pH值：pH2～8 有机溶剂的选择：甲醇、乙腈 （四）离子抑制色谱法 (