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蛋白质检测方法汇总 2010-04-26 12:00:38|??分类： 蛋白电泳 |??标签： |字号大中小?订阅 本文引用自啸月天狼《蛋白质检测方法汇总》 ? 更多相关资料请查看 蛋白质检测方法汇总 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。 了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 ? 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 ? 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑： ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： ? CH2COOH ? | ? ? ? ? + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 ? (1) ? NH2 ? ? 2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 ? ? ? ? ? ? ? (2) ? (NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 ? ? ? (3) ? ? 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 ? ? 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法 ? ? ?灵敏度 ? ? ?时间 ? ? ?原理 ? ? ?干扰物质 ? ? 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） ?灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ ? ? ?费时 ? 8～10小时 ? ? ?将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 ? ? ?非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） ? ? ?用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） ? ?灵敏度低1～20mg ? ?中速 ? 20~30分钟 ? ? ?多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 ? ? ?硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 ? ? ?用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 ? ? ?较为灵敏50～100mg ? ? ?快速 ? 5～10分钟 ? ? ?蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 ? ? ?各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 ? ? ?用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） ? ? ?灵敏度高～5mg ? ? ?慢速 40～60分钟 ? ? ?双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 ? ? ?硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 ? ? ?耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) ? ? ?灵敏度最高1～5mg ? ? ?快速5～15分钟 ? ? ?考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm ? ? ?强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS ? ? ?最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? H2O ? ? ? O=C ? ?