植物原生质体的分离与融合综述.pptVIP

实验九 植物原生质体分离及融合 制作人：眼睛咪咪 学习植物原生质体的分离及融合的原理，掌握其操作方法。 一、实验目的 植物原生质体是具有质膜，但去掉了细胞壁的植物细胞，分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁，进行连续的细胞分裂．并分化成完整植株的能力，即具有细胞全能性。细胞壁的主要成份是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶，果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁。 二、实验原理 由于质膜完全暴露，原生质体具有摄取大分子(如核酸)，细胞器(如核、叶绿体)和细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料。而原生质体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生物类型。 (一)材料：植物叶片(菠菜叶片) (二)用具：倒置显微镜，离心机。过滤筛(100目)，漏斗，烧杯，吸管，长注射 针，注射器(5-10m1)等； 三、实验用品 1．纤维素酶2％，果胶酶l％ ，在0.65M甘露醇，0.05MCaCl2·2H20和0.1％MES中，PH调至5.6-6.0。 2．0.16M CaCl2·2H20溶液(内含0.1％MES)PH5.6。 3．22％蔗糖溶液。 4．30％聚乙二醇(PEG)溶液 5．高PH高钙洗脱液(PH=9) 0.1M CaCl2·2H20 0.1M梨酶醇 0.5ml／100ml 1M Tris 6．0.24M CaCl2·2H20 (三)试剂： (一)原生质体的分离收集： 1.取菠菜叶片撕去下表皮，每小组称0.2g．切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解4-5小时，或酶含量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3．用与滤液等体积的0.16M CaCl2·2H20溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 四、实验方法 4.滤液用离心机100-300rpm，离心5分钟弃上清。 5.沉淀中加入0.16M CaCl2·2H20溶液1-2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入6-8ml 22％蔗糖溶液，使之形成界面。 6．静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管吸取收集原生质体。 7．用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心吸去上清液。 8．沉淀中加入l-2ml O.16M CaCl2·2H20溶液悬浮沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密度为2×105个／ml。 9．取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。 1．取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置l0分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。 2．在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴溶液相连，室温下(15℃-20℃) 作用5-l0分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。 (二)原生质体融合操作