第3章基因组学物理图绘制2例析.ppt

遗传图的缺点 遗传图的分辨率有限 基因组测序和组装所要求的标记密度是100kb。 遗传图的覆盖面较低 重组热点，倒位区段 遗传图分子标记的排列有时会出现差错 环境因素，取样误差 1. 限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置. 其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率. 通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图. 1.2 限制酶作图的改进 稀有切点限制图绘制注意事项: 有些限制酶识别位点较长 如酵母的Ⅰ-SceI识别顺序为18bp, TAGGGATAA/CAGGGTAAT 采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。 分辨力：10MB 垂直交变电场 ,两个电场方向成为直角 30Kb 10Mb DNA 片段 50Kb 1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。? ? 一、PFGE的基本原理? ? 脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。? ? PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。? ? 影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。 YAC 插入子稳定性问题,同一酵母细胞中多个YAC引起交换产生嵌合顺序 PBR322人工改造而来 色氨酸、鸟苷酸筛选，TRP和URAnium，基本培养基上筛选是否有这两个臂的基因。 SUP确定是否有插入片段，插入时，红色克隆，无克隆时显示白色 11.4kb 着丝粒 负责细胞分裂时染色体均等分配 端粒：保持人工染色体的稳定性。 自主复制起点：细胞染色体复制的启动 230kb-1700kb 标准操作为600kb，改进的1400kb 插入子不稳定 交换效应 嵌合序列 GC区克隆效率低 人类基因组中 BAC 来源于大肠杆菌中的天然F质粒,与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合),相对分子量大(具有较大容量),类似于制备质粒方法提取质粒,方便快捷 Cm氯霉素 Loxp 蛋白作用位点 ，可将环状DNA转变为线性DNA，p1 Cre蛋白作用位点 CosN伽马噬菌体末端酶专一性切割位点 2.2 重叠群组建 重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图. 重叠群的组建方法 染色体步移法 指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段; 一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征. 常用的指纹分析方法: Southern印迹法 常用的指纹分析方法: AluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物