生物物理课9-2指导.pptVIP

膜蛋白的结构研究 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 生物电子显微学 电子显微学研究生物大分子结构的主要方法 二维晶体 纤维或管状晶体 单颗粒生物大分子及复合体、病毒等 电子晶体学 单颗粒技术 亚细胞水平 电子断层成像术 生物大分子 生物大分子复合体 超分子复合体，细胞器，亚细胞结构 研究尺度 研究对象 研究方法 （周期排列） （全同粒子） （单一结构） 三维重构梗概中心截面定理与三维重构示意图。(A)：在X射线晶体学中通过对整个三维晶体的X射线衍射直接获得Fourier倒易空间的衍射信息，其与时空间的三维晶体是对应关系。(B)：在电子晶体学中，通过不同方向的投影及数字Fourier变换，获得的是其Fourier倒易空间不同中心截面的衍射信息，将所有不同方向投影的中心截面整合到一起，可以获得物体在整个三维Fourier倒易空间的衍射信息，通过逆变换同样可以获得该物体在实空间的图象。 三维重构的基本原理(中心截面定理) 将电子显微图像(实空间)进行傅里叶变换(倒易空间)，一张显微图像的傅里叶变换相应于成像物体在三维傅里叶变换(倒易空间)的一个通过中心的截面。通过改变生物样品在电镜下的倾斜角度，就可以得到相当于傅里叶变换(倒易空间)的其它通过中心的截面。收集在不同倾斜角度下样品的显微图像，经过傅里叶变换就可以获得一套完整的三维倒易空间数据。对样品的三维倒易空间数据进行傅里叶逆变换运算就可以获得该样品在实空间的三维结构图像。 电子晶体学（Electron Crystallography） 蛋白二维晶体样品 电子显微照片 倒易空间衍射谱 倒易空间信号信息 实空间蛋白质结构信息 电子显微镜 Fourier 变换 清除噪音 反Fourier 变换 电子晶体学的优势： 1.可以直接得到膜蛋白的结构信息以及与膜相关蛋白在膜上的结构信息。 2.可以获得高分辨率的结构，尤其适用于难于三维结晶的膜蛋白。 Bacteriohodopsin, Henderson et al.,1990; Plant light-harvesting complex, Kuhlbrandt, Wang, 1994; Aquaporin, Murata et al., 2000. 近年来迅速发展起来的单颗粒方法 （Single Particle Technique）是生物电子显微学的新方法,它克服了晶体学的限制。 顾名思义，单颗粒方法是对分离的，非有序排列的，但是相同的颗粒进行结构解析。其所采用的基本原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在实空间中经过调整后进行叠加平均，从而提高信噪比，使粒子中共同部分的结构信息得到加强，最后对各种不同投影方向的单颗粒显微像在三维空间中进行重构，从而获得单颗粒大分子的三维结构信息。 由于它处理的是同一大分子随机散布的电镜照片，所以没有形成晶体的要求。另外，单颗粒方法处理的生物大分子没有质量上限，而且分子越大，结果越好。 单颗粒技术（Single Particle Technique） 锥形采集法模型示意 单颗粒技术（Single Particle Technique） 单颗粒技术（Single Particle Technique） 蛋白质颗粒 电子显微照片 单颗粒图像 调整后的颗粒图像 实空间蛋白质结构信息 电子显微镜 Particle picking Alignment Classification Average 单颗粒技术的优势： 1.不需要二维晶体； 2.适于解决生物大分子复合体系的结构 应用举例： 用单颗粒技术研究核糖体(ribosome)的结构及其功能机制。 电子断层成像术（Electron Tomography) 细胞样品 一系列各角度的投影像 实空间的结构 建立模型 电镜观测 Backprojection Segmentation model 样品制备（固定，染色) 电子断层成像术（Electron Tomography) The three-dimensional reconstruction of an object from a serious of projections Electron Tomography 的优势： 1.适于解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系的结构； 2.适于揭示亚细胞层次的复杂结构。 Docking Technique 高分辨率结构 （来于X射线晶体学或NMR） 低分辨率结构 （来于电子显微术） Docking (manual docking or computational docking） 复合体的高分辨结构 maxi