细胞分子生物学（副本）.docVIP

细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学研究摘要：细鳞斜颌鲴（Xenocypris microlepis）属鲤形目，鲤科，亚科，属。俗称：沙姑子、黄片。我们将以中国细鳞斜颌鲴种群为研究对象，以基因组微卫星标记和线粒体D-loop标记为线索，研究细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学特征，探讨相互间的遗传结构、亲缘关系和系统进化关系，为进一步开发和利用细鳞斜颌鲴资源奠定基础。 关键字：细鳞斜颌鲴，线粒体D-loop标记，微卫星标记，遗传分化, 亲缘关系, 系统进化研究背景 2．方法2.1采样 分别采钱塘江，长江，珠江水系细鳞斜颌鲴—7个点，如钱塘江水系如图： 钱塘江水系采样图 每个采样点取30—40尾鱼尾鳍，用95%酒精保存备用。 2.2 基因组微卫星分子标记 微卫星DNA (MicrosatellitesDNA) 又称短串联重复序列( short tandem repeats, STRs) 或简单重复序列( simp le sequence repeats, SSRs) , 是广泛分布于真核生物基因组中的一种特殊序列, 主要由串联重复单元组成, 每单元长度为1～6 bp，重复数为10~20 次。它具有按照孟德尔方式分离、突变快、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点。它是继RFLPs标记之后发展起来的第二代分子标记,在水生经济动物的良种培育、群体遗传分析、亲子鉴定、遗传图谱构建、系统发育、医学及亲缘关系鉴定等研究领域表现出了广泛的应用价值。 微卫星DNA 标记具有突变率高、共显性好、多态信息容量高、特异性的PCR 扩增、引物通用性好、PCR扩增结果重复性好、技术难度低等特点，集中了其他分子标记的优点，被认为是研究群体遗传变异最好的标记方法之一。 微卫星DNA的重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的。这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列, 因此可以根据保守序列设计特异引物, 通过PCR 技术将中间的核心重复序列扩增出来, 利用琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术可获得其长度多态性SSR具有RFLP的所有遗传学优点,且避免了RFLP 技术中的使用放射性同位素的缺点,又比RAPD的重复性和稳定性高, 因而目前已成为遗传标记中的研究热点。然而由于SSR 技术必须针对每个染色体座位的微卫星, 发现其两端的单拷贝序列才能设计引物, 这给微卫星标记的开发带来一定的困难。 微卫星最突出的优点是具有高水平的变异，且其多态信息易于通过PCR技术获得，与同工酶或其它标记相比，微卫星更适合于亲缘关系较近的生物群体间的遗传关系研究。因此我们可以利用微卫星，大力开展水生动物特别是不同地理群体或品系的遗传结构研究。 本试验我们采用基因组微卫星标记, 来研究各伍氏华鳊种群的遗传分化，群体遗传多样性，探讨系统发生关系。 2. 线粒体D-loop环标记 自从Nass夫妇(1963 ) 发现线粒体DNA( mitochondrial DNA , mtDNA) 以来,核外遗传系统的研究逐渐成为分子遗传的重要研究领域之一。迄今已广泛应用于动物进化、动物遗传育种、动物保护生物学,动物亲缘关系鉴定、海关进出口动物产品鉴定等。 线粒体基因为非孟德尔式的遗传,在杂交后代中的表现不符合遗传学的三个基本规律,既不出现分离和自由组合现象,也不存在连锁与交换的关系。同时正反交结果也是不一样,杂种后代通常只表现母本的特征,而与父本性状无关,具有明显的核质基因互作关系。线粒体基因的遗传不是独立的遗传行为,常常表现为与核基因的相互作用。 在绝大多数动物中,线粒体基因组的结构为环状，包括编码区和非编码区。编码区内含有37 个基因:2 个SrRNA基因、22个tRNA基因、13个蛋白质基因（细胞色素C 氧化酶亚基Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ基因、细胞色素b脱氢酶基因、ATP合成酶6 和8 、NADH脱氢酶亚基126 和4L）。非编码区是线粒体基因组的调控区，又称为D 环(D-loop) 。Cytb，12SrRNA，16SrRNA，ATP8等基因多用于研究物种间系统发育和基因的进化；D-loop 区序列多用于研究物种的遗传多样性、群体遗传结构及亚种的分化。 D-loop(displacement-loop region)占mtDNA的6％左右，不同动物的D-loop分子大小差异很大，从几百个碱基到几千个碱基不等，同一物种其大小也有略微差异，各种动物D—loop结构也不尽相同。D-loop也是mtDNA复制与转录的关键部位，因此又把它称为线粒体的控制区(control region)。在碱基组成上，D-loop为A-T富集区，依照碱基A的比率，又可分为左功能区(包括D-oop的5’端)、中间保守区和右功能区(包括D-loop的