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找答案？ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？ 核酸制备基本步骤？ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ 核酸的保存方法有哪些？ 核酸的分离和纯化 前言 核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 核酸的分类： DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 主要内容 1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介 1. 核酸分离与纯化的原则及要求 1.1 核酸分离与纯化的一般原则 (1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。 (2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。 1.2 核酸分离与纯化的要求 (1) 为保证核酸的完整性， （防止降解），在实验中应注意： 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。 化学因素？ 生物因素？ 物理因素？ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。 所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。 DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。 RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃干烤8h。 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。 高温，如长时间的煮沸。 (2) 核酸纯度的要求： 非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子； 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物； 去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。 2. 核酸制备的基本步骤 2.1 破碎细胞 (1)玻璃匀浆器匀浆 (2)液氮研磨法 富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；富含胶原蛋白的皮肤、肌腱；坚硬的组织如骨骼。 (3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法 (5)化学处理法(SDS、吐温80等） (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等） 2.2 核酸分离，去除蛋白 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 （1）加入SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； （2） 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； （3）酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。 (1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。 使用酚时应注意 2.3 沉淀核酸 重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。 核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸 2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。 钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。 核酸沉淀的盐类及浓度 盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L) MgCl2 1 0.01 NaAc 3 (pH5.2) 0.3 KAc 3 (pH5.2) 0.3 NH4Ac 10 2.5 NaCl 5 0.2 LiCl 8 0.8 乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。 异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的